Summary

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف<em> E. القولونية</emموصوفة> والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

Abstract

السموم البكتيرية ربط الكوليسترول في الأغشية، وتشكيل المسام التي تسمح لتسرب محتويات الخلوية وتدفق المواد من البيئة الخارجية. يمكن استرداد الخلية إما من هذه الإهانة، الأمر الذي يتطلب عمليات إصلاح غشاء بالموقع، وإلا يموت اعتمادا على كمية التعرض للسموم ونوع من الخلايا 1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه السموم لحث على الاستجابة للالتهابات قوية في المضيفين المصابة من خلال تنشيط خلايا المناعة، بما في ذلك الضامة، والتي تنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات 2. كثير من البكتيريا إيجابية الجرام تنتج السموم ملزمة الكوليسترول التي ثبت للمساهمة في الفوعة من خلال آليات uncharacterized إلى حد كبير.

التغييرات الشكلية في غشاء البلازما من الخلايا المعرضة لهذه السموم تتضمن تنحية بهم إلى السطح نتوءات الكولسترول عالي التخصيب، والتي يمكن تسليط في الفضاء خارج الخلية مما يدل على أن الدفاع الجوهرية الخلويةآلية 3،4. هذه العملية تحدث في جميع الخلايا في حالة عدم وجود النشاط الأيضي، ويمكن تصور استخدام EM بعد 4 تثبيت الكيميائية. في الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية التي تتوسط الالتهاب ردا على التعرض للسموم، واقترح الحويصلات الغشاء يسببها لاحتواء السيتوكينات من عائلة IL-1 وربما تكون مسؤولة على حد سواء لسفك السم ونشر هذه السيتوكينات الموالية للالتهابات 5،6،7. A الرابط بين IL-1β الإفراج ونوع معين من موت الخلايا، وقد اقترح تسميته pyroptosis، وكلاهما العمليات كاسباس-1 تعتمد 8. لفرز تعقيدات هذا الرد البلاعم، والذي يتضمن ربط السم، متراجعا من الحويصلات الغشاء، وإطلاق سراح خلوى، وموت الخلايا يحتمل، وقد وضعنا أساليب التصنيف وطرق الفحص المجهري مضان التي تسمح لتصور الوقت الحقيقي من السم خلايا التفاعلات، بما في ذلك قياسات ضعف والموت (الشكل 1). استخدمالتصوير الخلية الحية ضروري بسبب قيود في تقنيات أخرى. ويمكن للنهج البيوكيميائية يتم تحليل التأثيرات التي تحدث في الخلايا الفردية، في حين أن التدفق الخلوي لا يقدم عالية الجودة، في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لتحليل الحركية من الردود الناجمة عن المنبهات الأخرى التي تنطوي على تغييرات في الخلايا المعقدة المظهري.

Protocol

1. تنقية O ستربتوليزين (SLO) تطعيم 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا التي تحتوي على BL21 GOLD-pBADgIII SLOhis البلازميد 9 الى 0.5 لتر مرق LB وإضافة 500 ميكرولتر 50 ملغ / مل الأمبيسلين. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة الثقافة في C ° 37 حت?…

Representative Results

يمكن عادة 10 7 8 -10 يمكن الحصول عليها U / مل SLO مع تركيز البروتين من 4 ملغ / مل. كمية السم اللازمة لتحلل الخلايا تختلف وفقا لنوع الخلية، ولكن عادة ما يكون 125-500 U / مل SLO (الشكل 2B). يمكن أنواع الخلايا مثل الخلايا البلعمية تكون أكثر مقاومة (4000 U / مل) على الرغم من الآخر…

Discussion

وصف تقنيات تسمح هنا النظر في ردود الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. الخطوة الأكثر أهمية هو التعامل مع والجرعات من السم. يمكن أن يكون النشاط السم متغير للغاية، حتى بين مختلف مأخوذة من إعداد نفسه، بسبب هشاشتها. هذا يتطلب اختبار إما كل قسامة من السم ضد مرجع الخلية أو خط…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر ريتشارد الراحة للهدية سخية من anthrolysin O، مايكل Caparon لهدية سخية من الفرنجة SLO البلازميد وجوناثان لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح T32CA82084 (PAK)، وR01AI072083 (RDS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
polymixin-agarose Sigma P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col Fisher PI-89891
sheep RBCs Fisher 50-415-688
pBADgIII-SLO N/A N/A see ref9
Cy5 monoreactive dye GE Healthcare PA25001
Fura2-AM Life Technologies F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer Life Technologies L3224
Anti-CD11c-APC BD Biosciences 550261
collagen-coated glass-bottom dish Mattek P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II Fisher E5242957000
Microloader Fisher E5242956003
dextran Alexa 555 Life Technologies D34679
Injectman NI 2 Eppendorf 920000029
FemtoJet Eppendorf 5247 000.013

Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.

Buffer Composition Step Used
Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazole, pH 8.0
1.4
Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
1.7
Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
250 mM imidazole
1.8
RBC Assay buffer 0.3% BSA
2 mM CaCl2
10 mM HEPES, pH 7.4
2.1
buffer R/B RPMI cell culture medium
2 mM CaCl2
0.5% BSA
3.1

Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.

References

  1. Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
  2. Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
  3. Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
  4. Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
  5. MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
  6. Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
  7. Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
  8. Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
  9. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
  10. Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
  11. Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
  12. McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
  13. Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).

Play Video

Citer Cet Article
Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4227, doi:10.3791/4227 (2012).

View Video