ويرد وصف أداة وكيمياء لعزل بالتسلسل الأحماض النووية تليها البروتينات من عينة من دون الحاجة للحصول على الكهرباء. أداة تتكون من المواد الماصة التي عقدت ضمن ماصة نقل في حين تستند على مبادئ كيمياء العزلة استخراج الصلبة المرحلة. يمكن تحليل الجزيئات المعزولة بواسطة المقايسات المناعية القاعدة والقائم على PCR.
مسببات الأمراض التقليدية والناشئة، مثل كولاي Enterohemorrhagic (EHEC)، طاعون يرسينيا، أو الأمراض البريونية المستندة إلى مصدر قلق كبير بالنسبة للحكومات والصناعات والمهن الطبية في جميع أنحاء العالم. على سبيل المثال، EHECs، جنبا إلى جنب مع الشغيلة، هي المسؤولة عن وفاة ما يقرب من 325000 طفل كل عام، وتنتشر بشكل خاص في العالم النامي حيث المختبرات لتحديد الهوية، وشائع في الولايات المتحدة، غير متوفرة 1. تطوير وتوزيع منخفضة التكلفة، ويمكن على الصعيد الميداني، نقطة من الرعاية أدوات للمساعدة في التعرف السريع و / أو تشخيص مسببات الأمراض أو علامات المرض تغير بشكل كبير تطور المرض والتشخيص للمرضى. قمنا بتطوير أداة لعزل الأحماض النووية والبروتينات من عينة بواسطة الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) من دون كهرباء أو يرتبط بها من معدات المختبرات 2. يمكن استخدام الجزيئات معزولة عن diagnoالهيئة العامة للاستعلامات سواء في المختبر أو إلى الأمام باستخدام الميدانية نقطة من الرعاية المنصات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يوفر للمقارنة المباشر للحامض النووي وبيانات بروتين من عينة من الامم المتحدة والانقسام، وتقدم الثقة من خلال التثبت من التحليل الجيني والبروتين.
أداة لدينا العزلة يستخدم معيار الصناعة لالصلبة مرحلة العزلة الحمض النووي، والتكنولوجيا الازدهار، الذي يعزل الأحماض النووية من محلول ملحي chaotropic، وعادة ما جوانيداين الفصيلة، من خلال الربط إلى السيليكا المستندة إلى جزيئات أو 3 مرشحات. ويستخدم CUBRC في الملكية كيمياء استخراج الصلبة مرحلة لتنقية البروتين من الحلول ملح chaotropic، في هذه الحالة، من النفايات أو من خلال تدفق، بعد عزل الحمض النووي 4.
من قبل التعبئة والتغليف جيدا تتميز كيمياء في منصة صغيرة وغير مكلفة وبسيطة، لقد ولدت لدينا نظام محمول للحامض النووي واستخراج البروتين التي يمكن القيام بها في ظل فارiety من الشروط. الأحماض النووية المعزولة في حالة مستقرة ويمكن أن ينتقل إلى وضع يمكنها من حيث القوة هو متاح لتضخيم PCR بينما يمكن على الفور محتوى البروتين يمكن تحليلها بواسطة باليد أو غيرها من المقايسات المناعية مقرها. ويمكن التعرف السريع على علامات مرض في مجال تغير بشكل ملحوظ نتيجة للمريض من خلال توجيه مسار السليم للعلاج في مرحلة مبكرة من تطور المرض. الأداة والطريقة الموصوفة هي مناسبة للاستخدام مع وكيل أي عمليا المعدية وتوفر للمستخدم التكرار نوع من التحليلات المتعددة جزيء في الوقت ذاته من عبء لوجستية.
الأداة، كيمياء وبروتوكول المبينة في هذا التقرير تمثل أول مثال معروف من الكهرباء خالية، نظام استخراج متعددة جزيء التي يمكن استخدامها في مجال التطبيقات المستندة إلى نقطة من الرعاية، و. ويمكن تطبيق هذين النوعين جزيء إلى عدد من المتلقين للأجهزة التشخيص أو التحليلية. على سبيل المثال، الأحماض النووية المعزولة هي من نوعية PCR (الشكل 2 و 3) في حين أن البروتين مكون من العينة هو متفاعل مناعيا (الشكل 4). ويمكن الاستفادة من هذا النظام استخراج في مناطق محدودة التقشف أو مورد في العالم خفض كبير في عبء المرض على السكان الذين يعيشون هناك. ويمكن هذا النظام استخلاص تساعد أيضا في برامج مراقبة الأمراض في جميع أنحاء العالم من خلال توفير وسيلة قوية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لتجهيز العينات في مواقع التقشف أو بعيد.
أحد الجوانب الهامة لطريقة استخراج المبينة أعلاه هو أنيمكن تعديله من قبل المستخدم. على سبيل المثال، في الحالات التي يكون فيها حجم العينة أكبر أو أقل من 500 μLs الأولية (الخطوة 1.2)، يمكن للمستخدم ضبط كميات من المواد الكاشفة وفقا لذلك. وهذا هو، على نسبة حجمية من الكواشف لحجم العينة يجب أن تبقى ثابتة بينما يمكن تغيير وحدات التخزين مطلقة. أيضا، ويمكن أيضا إدخال تعديلات على عدد من الممرات خلال ماصة يتم وفقا لتقدير المستخدم. وعلى سبيل المثال، إذا تم استخدام حجم أكبر عينة، ويمر على عينة أكثر من مرة في أكثر من المواد الماصة المذكورة (الخطوات 2،4 و 3.3) تزيد من احتمال نوع جزيء (الحامض النووي أو البروتين) الاتصال المواد الماصة. وينبغي أن الزيادة في الممرات زيادة كفاءة التقاط حتى يتم التوصل إلى تشبع المواد الماصة.
لقد وجدنا أن أداة استخراج وكيمياء يرتبط بها من بعض القيود، وأهمها هو أن كيمياء استخراج بروتين غير فعالة لاسترداد الغليكوزيلاتي جداالبروتينات. في حال التشخيص المصب يستهدف بروتين الغليكوزيلاتي، وهذا قد لا يكون مثاليا نظام لتحديد الهوية. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال في الحدود العليا والدنيا من الكفاءة سواء لاستخلاص الأحماض النووية أو البروتينات التي يجري تحديدها، والتحسين جار لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الانتعاش. ومزيد من تطوير أداة تغلب على هذه الفجوات في المعرفة الحالية.
The authors have nothing to disclose.
وقدمت التمويل اللازم لتطوير ماصة في استخراج جزء من قبل البحوث الداخلية ومنح التنمية التي منحت لDRP.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |