חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

בידוד חומצות גרעין: חומצות גרעין הן מבודדות PCR amplifiable וללא זיהום חלבון. דוגמה 1: חומצות גרעין שנמצאו מתאימים לשימוש ב PCR יישומים מבוססי. לדוגמה, תרשים 2 מציג הגברה של גנים Shiga הרעלן הקשורים Enterohemorrhagic א ' coli O157: H7 המתח אדי-933 (ATCC # 35150) מההליך חומצה / חלבון גרעין החילוץ באמצעות פיפטה החילוץ. גנים את הרעלן Shiga stx 1 ו 2 stx נמצאים על bacteriophage למבדה כמו ממוזג ופגום bacteriophage זו ואחרות Enterohemorrhagic א ' קולי זנים הנתון לשליטתו של היזם P R 5 6 7 8. ההפעלה של התגובה SOS ב א coli גורם prophage ואינדוקציה / או ייצור הרעלן 9. שמנו מנוצל גירסה שונה של assay PCR מרובב על ידי פנג et al. 11 לזהות stx 1 ו – 2 גנים stx בתרבות והן דגימות שפכים חדים. מסלולים A ו-B באיור 2 מראים את התוצאות של הגברה PCR מדגם תרבות מעובד (מסלול) ו מדגם תרבות מעובד (מסלול ב '). תוצאות אלו משמעות זהה כמעט אין אובדן הנאמנות של חומצות גרעין מעובדים או מבודד. אנו מוגבר הבא ביוב גולמי המחודד (נתיב ד ') או חומצות גרעין מבודדים מן הביוב המחודד (נתיבי E & F). נתונים אלו מעידים כי חומצות גרעין בודדים הביא הגברה גדולה יותר לעומת הלא מבודדים חומצות גרעין מ דגימות שפכים חדים. לפיכך, אנו מסיקים כי בין אם מעכבי ה-PCR נמצא באופן טבעי הביוב הוסרו על בידוד או חומצות גרעין רוכזו על הבידוד. השילוב של שני אלה השערות הוא גם אפשרי. ספקטרוסקופיה אולטרה סגול שימש הבא כדי להראות את חומצות גרעין בודדים היו חופשיים יחסית Oחלבון ו מזהם. איור 3 מציג את ספקטרום UV של 2 א ​​' coli O157: H7 גרעין חומצה עקירות, בידוד שכותרתו א 'וב' בידוד, לעומת הספקטרום מנורמל של התרבות חיידקים, שכותרתו בידוד מראש. ספקטרום UV של חומצות גרעין מבודדים דומה את הספקטרום של חומצות גרעין טהור, בעל היחס מחושב של ספיגת בין 260 ננומטר ו -280 ננומטר המתקרבים 1.8 10. נתונים אלו מראים כי יש מעט מאוד חלבון זיהום בשבריר חומצות גרעין התאושש תוך שימוש בטכניקה המתוארת. בידוד חלבון: חלבון התאושש הניסוי חומצה / חלבון גרעין הבידוד הוא immunoreactive וזהה electrophoretically לחלבון טהור. דוגמא 2: חלק החלבון המבודד היה מוחל על ה RapidChek קולי O157 לרוחב תזרים assay רצועות (SDIX, Inc). בקרת להראות הזדהות חיובית בכל דגימות מחסה א ' coli O157, עם או בלי אינדוקציה STX (איור 4, נתיבי B ו-C, בהתאמה). הנתונים גם מראים איור 4 תוצאות חיוביות עבור אותם דגימות מחסה א ' coli O157 שעובדו על חומצות גרעין ולאחר מכן חלבון בעזרת פיפטה החילוץ. נתונים אלו מראים כי חלבון מבודד מכל מדגם הוא immunoreactive ובכך מפעילה תגובה חיובית. הגברה PCR (כמתואר דוגמה 1) בוצע על דגימות חלבון להראות כי חלק החלבון המבודד היה נטול זיהום חומצות גרעין. את התוצאות של ניסויים אלה היו שליליות על ידי ג'ל אלקטרופורזה. לכן, אנו מגיעים למסקנה כי תכולת החלבון המדגם הופרד זיהום חומצות גרעין. תוצאות אלו, נלקח עם כל אלה תיאר את המופע צעד בידוד גרעין חומצה כי חומצות גרעין ותוכן חלבון מבודדים צעדים שהכינו. t "> דוגמה 3:. חלבון מבודד מתאים אלקטרופורזה 10 איור 5 מתאר coomassie מוכתם ג'ל acrylamide 8% עמוסה BSA (איור 5, נתיבי & C) BSA מבודד isothiocyanate guanidine 6M באמצעות מיצוי פיפטה הקשורים פרוטוקול. ניידות electrophoretic של חלבון מבודד זהה לזה של דגימות בקרה. כך אנו מסיקים כי תהליך החילוץ אינו משנה את מבנה קוולנטי של חלבון מבודד. איור 1, פאנל: תיאור של הליך מיצוי טיפוסי גרעין חומצה המדגם הוא מעורבב עם thiocyanate guanidine 6M בצינור המדגם עברו במהלך חמש פעמים sorbent.. לאחר המעבר האחרון, מדגם מתווסף למאגר מיצוי חלבון. חומצות גרעין sorbent ואת כפות נשטפים פעמיים עם אתנול. המדגם הוא אז באוויר DRied ו eluted מ sorbent. תרשים 1, לוח ב ': תיאור של הליך חלבון אופייני החילוץ מדגם מעורבב עם מאגר חלבון במנותק שלב 1, איור 1, פאנל הוא חלף על פני sorbent של טפטפת ממוצא 2 15 פעמים.. המשך התהליך זהה לזה של פרוטוקול חומצות גרעין החילוץ. איור 2:. תמונה שלילית של ברומיד צבעונית ethidium agarose ג'ל מרובב Shiga רעלן 1 ו 2 הגברה ניסוי גנטי בוצע באמצעות דגימות תרבות נתיבים (A ו-B) או דוגמאות שפכים גולמיים מעוטרות א ' coli O157: H7 (נתיבי D, E ו-F). הדגימות היו או להוסיף ישירות לצינור התגובה PCR (נתיבי A ו-D) או את הדוגמאות עובדו באמצעות proces בידודs ואת חומצות גרעין שחולצו נוספו צינור התגובה PCR (דוגמאות B, E ו-F). פרוטוקול ה-PCR היא שינוי של 1 תיאר פנג ואח' 11. שינוי שלנו ממוקד רק אלה מוגבר על ידי stx 1 (הלהקה התחתון) ו stx 2 (הלהקה העליון) זוגות פריימר, שומטת את כל זוגות פריימר אחרים. ליין C הוא סולם מ 1KB BioRad. איור 3: תוצאות ספקטרוסקופיה UV של א ' coli O157: H7 חומצות גרעין בודד באמצעות פיפטה החילוץ דיווחו על חומצות גרעין בודדים מסומנים בידוד A ו-B בידוד.. ספקטרום UV של המדגם נבדק גם לפני מיצוי חומצות גרעין מתויג מראש בידוד. ספקטרום התקבלו באמצעות U3010 Hitachi ספקטרופוטומטר חבילת הקשורים תוכנה. <br/> איור 4:. צילום צבע של רצועות הבדיקה RapidChek תוכן החלבון של דגימות בשימוש בתרשים 2 היה מבודד באמצעות פיפטה החילוץ ונבדקו על תגובתיות-חיסונית על ידי assay הזרימה לרוחב. נתיבי AC הם פקדים לא מעובדים, כלומר, תרבית תאים זה התווסף פס הבדיקה ללא חומצות גרעין או מיצוי חלבון. ליין הוא ה קולי BL21 DE3 pLysS כביקורת שלילית, Lanes B ו-C הצג E. coli O157: H7, כי היה מטופל (ב), או שטופלו mitomycin C למשך 4 שעות (C). מסלולים ד עד h להראות את התוצאות של הוספת חלבון המופק על מקלוני הבדיקה לרוחב הזרימה. נתיבי D ו-E נבדקו באמצעות תמצית חלבון מן ה coli BL21 DE3 pLysS או בלי (ד ') או עם mitomycin C טיפול (ה) לצורך ביקורת שלילית. נתיבי FH להציג את התוצאות כאשר חלבון המופק מן ה coli O157: H7 היה בשימוש. חלבון היה שחולצו מן מטופל (F), או משעה 2 (ג) או 4 שעות (H) mitomycin תרבויות ג שטופלו.תוצאות חיוביות לייצר קו אדום כפול. איור 5:. צילום צבעונית Coomassie SDS-PAGE BSA היה מבודד מן הפתרון באמצעות פיפטה החילוץ ופרוטוקולים המתוארים. מסלולים A ו-C הם נתיבים שליטה של ​​250 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו – 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאמה. נתיבי B ו-D מתארים BSA התאושש פתרונות המכילים ריכוז זהה בקרות בהתאמה.