Electricité-libre, l'acide nucléique et séquentielle isolement des protéines

Isolement d'acide nucléique: des acides nucléiques isolés sont PCR amplifiable et libre de toute contamination de protéines. Exemple 1: Les acides nucléiques sont récupérés peut être utilisé dans des applications basées sur la PCR. Par exemple, la figure 2 montre l'amplification de gènes de la toxine shiga associés à entérohémorragique E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) à partir d'une procédure d'extraction d'acide / protéine nucléique à l'aide de la pipette d'extraction. Les gènes de la toxine shiga stx 1 et stx 2 sont disponibles sur tempérée lambda-comme les bactériophages et défectueux dans ce bactériophage et autres entérohémorragique E. souches de E. sous le contrôle du promoteur P R 5 6 7 8. L'activation de la réponse SOS dans E. coli conduit à prophage induction et / ou de la toxine de production 9. Nous avons utilisé une version modifiée de l'essai multiplex PCR par Feng et al. 11 pour déterminer le stx 1 et stx 2 gènes à la fois dans la culture et des échantillons d'eaux usées à pointes. Colonnes A et B dans la figure 2 montrent les résultats d'une amplification par PCR d'un échantillon de culture non transformées (voie A) et un échantillon de culture traitée (voie B). Ces résultats sont pratiquement identiques sens il n'ya pas de perte de fidélité dans les acides nucléiques isolée ou transformés. Nous avons ensuite amplifié à pointes eaux d'égout brutes (colonne D) ou des acides nucléiques isolés à partir des eaux usées à pointes (voies E & F). Ces données indiquent que les acides nucléiques isolés abouti à une plus grande amplification par rapport aux acides nucléiques isolés non à partir d'échantillons d'eaux usées à pointes. Nous concluons donc que soit inhibiteurs de la PCR naturellement présents dans les eaux usées ont été enlevés lors de l'isolement ou que les acides nucléiques ont été concentrées sur l'isolement. Une combinaison de ces deux hypothèses est également possible. Spectroscopie dans l'ultraviolet a ensuite été utilisé pour montrer que les acides nucléiques isolés étaient relativement libres oprotéines f contamination. La figure 3 montre les spectres UV de deux E. coli O157: H7 nucléique extractions acide, l'isolement marqué a et b isolement, par rapport au spectre normalisé de la culture bactérienne, marqué pré-isolement. Le spectre UV des acides nucléiques isolés ressemble les spectres de purs des acides nucléiques, ayant un rapport calculé de l'absorbance entre 260 nm et 280 nm qui approchent 1,8 10. Ces données montrent qu'il ya très peu de protéine contaminante dans la fraction d'acide nucléique récupéré en utilisant la technique décrite. L'isolement des protéines: les protéines récupérées de l'expérience d'isolement d'acide / protéine nucléique est immunoréactif et électrophorèse identique à la protéine pure. Exemple 2: La fraction de protéine isolée a été appliqué à l'E. RapidChek coli O157 latérales des bandes d'essai d'écoulement (SDIX, Inc.) Contrôles montrent une identification positive dans tous les échantillons hébergeant E. coli O157, avec ou sans induction STX (Figure 4, les voies B et C, respectivement). Les données de la figure 4 montrent aussi des résultats positifs pour les échantillons hébergeant E. coli O157 qui ont été traitées pour les acides nucléiques et de protéines, puis à l'aide de la pipette d'extraction. Ces données montrent que la protéine isolée à partir de chaque échantillon est immunoréactif déclenchant ainsi une réponse positive. Amplification par PCR (tel que décrit dans l'exemple 1) a été effectuée sur les échantillons de protéines pour montrer que la fraction protéique isolée était dépourvue d'acides nucléiques contaminants. Les résultats de ces expériences étaient tous négatifs par électrophorèse sur gel. Ainsi, nous concluons que la teneur en protéines de l'échantillon a été séparé de contaminer les acides nucléiques. Ces résultats, pris dans son ensemble à celles décrites pour le spectacle étape d'acide nucléique isolée que les acides nucléiques et en protéines sont isolés dans différentes étapes de fractionnement. t "> Exemple 3:. La protéine isolée est adapté pour l'électrophorèse 10 Figure 5 représente une coomassie colorée gel d'acrylamide 8% chargé avec de la BSA (Figure 5, les voies A et C) et de la BSA isolé de 6M isothiocyanate de guanidine en utilisant l'extraction et la pipette associé protocole. La mobilité électrophorétique de la protéine isolée est identique à celle des échantillons de contrôle. Nous concluons donc que le processus d'extraction ne modifie pas la structure covalente de la protéine isolée. Figure 1, Groupe A: Représentation d'une procédure de type extraction d'acide nucléique L'échantillon est mélangé avec 6M de thiocyanate de guanidine dans le tube d'échantillon et passé au cours des cinq absorbants fois.. Après le dernier passage, l'échantillon est ajouté à la mémoire tampon d'extraction de protéines. Les acides nucléiques sorbant et lié sont lavées deux fois avec de l'éthanol. L'échantillon est alors l'air dRied et éluée à partir du sorbant. Figure 1, Groupe B: Représentation d'une procédure d'extraction des protéines typiques L'échantillon mélangé avec du tampon de l'isolement des protéines à partir de l'étape 1, Figure 1, partie A est passé sur le sorbant d'une pipette seconde extraction 15 fois.. Le reste de la procédure est identique à celle du protocole d'extraction d'acide nucléique. Figure 2:. Image négative d'un bromure d'éthidium gel d'agarose coloré multiplexé toxine de Shiga 1 et 2 l'expérience d'amplification génique a été réalisée en utilisant des échantillons de culture (voies A et B) ou des échantillons d'eaux usées brutes dopés avec E. coli O157: H7 (voies D, E et F). Les échantillons ont été soit directement ajoutés à un tube de réaction PCR (voies A et D) ou les échantillons ont été traités à l'aide des procès d'isolements et les acides nucléiques extraits ont été ajoutés au tube de réaction PCR (échantillons B, E et F). Le protocole de PCR est une modification de celle qui est décrite par Feng et al 11. Notre modification ciblée seulement ceux amplifié par le stx 1 (bande inférieure) et stx 2 (bande supérieure) paires d'amorces, l'abandon de toutes les paires d'amorces d'autres. Lane C est l'échelle 1Ko de BioRad. Figure 3: résultats de spectroscopie UV de E. coli O157: H7 acides nucléiques isolés à l'aide de la pipette d'extraction ont rapporté les acides nucléiques isolés sont marqués d'isolement b isolement a et.. Le spectre UV de l'échantillon a également été testée avant l'extraction des acides nucléiques et est étiqueté pré-isolement. Les spectres ont été obtenus en utilisant un spectrophotomètre Hitachi U3010 et un logiciel associé. <br/> Figure 4:. Photo couleur de bandelettes de test RapidChek La teneur en protéines des échantillons utilisés dans la figure 2 a été isolé à l'aide de la pipette d'extraction et testés pour l'immuno-réactivité par un test d'écoulement latéral. Lanes AC sont des contrôles non traités, qui est, de culture cellulaire a été ajouté à la bandelette de test sans acide nucléique ou l'extraction des protéines. Lane A est E. coli BL21 pLysS de3 comme un contrôle négatif, Lanes B et C montrent E. coli O157: H7 qui a été traitée (B), ou traitées à la mitomycine C pendant 4 heures (C). Lanes D à H montrent les résultats de l'ajout de la protéine extraite des bandes latérales des essais de débit. Lanes D et E ont été sondés à l'aide extrait de protéine de E. coli BL21 DE3 pLysS soit sans (D) ou à la mitomycine C traitement (E) comme témoins négatifs. Lanes FH montrent les résultats lors de l'extraction des protéines de E. coli O157: H7 a été utilisé. Protéine a été extrait de non traitée (F), ou de 2 heures (G) ou 4 heures (H) mitomycine C cultures traitées.Les résultats positifs de produire une double ligne rouge. Figure 5:. Photographie d'un teint de Coomassie SDS-PAGE BSA a été isolé de la solution en utilisant la pipette d'extraction et de protocoles décrits. Colonnes A et C sont des files de contrôle de 250 pg / mL et 500 pg / mL, respectivement. Colonnes B et D représentent BSA récupéré à partir de solutions contenant les mêmes concentrations que leurs témoins respectifs.