שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול
Summary
הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.
Abstract
מודלים של בעלי חיים קטנים כגון עכברים נעשו שימוש נרחב על מחלה אנושית ולפתח התערבויות טיפוליות חדשות. למרות השפע של מידע המתקבל ממחקרים אלה, המאפיינים הייחודיים של חסינות עכבר כמו גם את הספציפיות של מיני מחלות נגיפיות כמו נגיף כשל חיסוני אנושי (HIV) זיהום הובילו לפיתוח של מודלים עכבריים. הדגמים הקודמים כללו שימוש בג B 17 עכברים SCID / SCID וההשתלה של בלוטת התימוס האנושי עוברית וכבד עובריים מכונית / ליב (SCID-hu) 1, 2 או העברת המאמצת של לויקוציטים דם ההיקפי אדם (SCID-huPBL ) 3. שני הדגמים נוצלו בעיקר לצורך הלימוד של ההידבקות ב-HIV.
אחת המגבלות העיקריות של שני מודלים אלה היה חוסר יציבות הכינון מחדש של תאי מערכת חיסון אנושיים בפריפריה כדי להפוך אותם יותר מבחינה פיזיולוגית מודל רלוונטי על מחלת איידס. לשם כך, זמזום BLTמודל העכבר anized פותח. BLT עומד למח עצם / כבד / התימוס. במודל זה, 6-8 בן השבוע NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) עכברי מדוכאי חיסון יקבל את שתלך / ליב כמו במודל של עכברי SCID-hu רק כדי להיות אחרי השתלה שנית אדם גזע hematopoietic תא 4. היתרון של שיטה זו הוא הכינון מחדש המלא של מערכת החיסון האנושית בפריפריה. דגם זה נעשה שימוש כדי לחקור הדבקה ב-HIV והשהיה 5-8.
לנו שנוצרנו גרסה שונה של מודל זה שבו אנו משתמשים בשינוי גנטי בתאי גזע hematopoietic אדם (hHSC) כדי לבנות את שתלך / ליב אחרי ההזרקה של transduced עצמי 7 hHSC, 9. גישה זו גורמת לדור של שושלות מהונדסות גנטי. וחשוב יותר, התאמן במערכת זו כדי לבחון את הפוטנציאל של יצירת תאי T ציטוטוקסיים תפקודיים (CTL) מבטא רצפטור תא T ספציפי מלנומה. שימוש במודל זה היינו יכול להעריך את הפונקציונליות של CTL המהונדס ניצול חייה פליטת פוזיטרוני הדמית טומוגרפיה (PET) כדי לקבוע נסיגת גידול (9).
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את תהליך יצירת העכברים הטרנסגניים הללו והערכה ביעילות vivo שימוש בבדיקה PET חי. בתור הערה, שכן אנו משתמשים רקמות אדם ווקטורי lentiviral, המתקנים שלנו תואמים את הנחיות ה-CDC NIH לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחד (BSL2 +). בנוסף, עכברי NSG הם immunocompromised קשות וכך, הדיור ואחזקתם חייב לעמוד בסטנדרטים הגבוהים ביותר לבריאות (http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html).
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל השונה BLT אנושי העכבר בשילוב עם in vivo PET ההדמיה הם כלים רבים עצמה כדי לחקור מחלות אנושיות כרוניות. מערכת זו לוקחת את מודל עכבר BLT והתקדמותה אל מעבר להיקף המוגבל למחקר איידס. בנוסף, מדובר במערכת גדולה שבה אנו יכולים לבחון פרוטוקולים שונים ריפוי גנטיים, כמו גם טכ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאלווין וולש ולארי פאנג לסיוע הטכני שלהם. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בפרס P50 CA086306, קליפורניה המכון לרפואת הרגנרציה (CIRM) מענקי RC1-00149-1 וRS1-00203-1; פקולטת הפרס החדש CIRM RN2-00902-1 , מרכז קלטק-UCLA המשותף לTranslational רפואה, אוניברסיטת קליפורניה במרכז לחקר מחלת איידס (CFAR) NIH / NIAID AI028697, אוניברסיטת UCLA איידס המכון, כלי CIRM ופרס הטכנולוגיה RT1-01126, ותכנית מחקר Multicampus UC והיוזמות מקליפורניה מרכז לגילוי תרופות אנטי (המספר MRPI-143226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
