Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel
Summary
Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.
Abstract
Kleine diermodellen zoals muizen zijn uitgebreid gebruikt om menselijke ziekte te bestuderen en nieuwe therapeutische interventies. Ondanks de vele informatie uit deze studies de unieke kenmerken van muis immuniteit en de soortspecificiteit van virale ziekten zoals humaan immunodeficiëntie virus (HIV) infectie leidde tot de ontwikkeling van gehumaniseerd muismodellen. De oudere modellen werd gebruik gemaakt van C. B 17 scid / scid muizen en transplantatie van humane foetale thymus en foetale lever genoemd thy / liv (SCID-hu) 1, 2 of de adoptieve overdracht van humaan perifeer bloed leukocyten (SCID-huPBL ) 3. Beide modellen werden voornamelijk gebruikt voor de studie van HIV infectie.
Een van de belangrijkste beperkingen van beide modellen was het gebrek aan stabiele reconstitutie van humane immuuncellen in de periferie om ze een fysiologisch relevant model voor HIV ziekte te bestuderen. Hiertoe de BLT humanized muismodel ontwikkeld. BLT staat voor beenmerg / lever / thymus. In dit model, 6 tot 8 weken oude NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunodeficiënte muizen krijgen de thy / liv implantaat in het SCID-hu muismodel alleen worden gevolgd door een tweede humane hematopoietische stamcel transplantatie 4. Het voordeel van dit systeem is volledig herstel van het menselijke immuunsysteem in de periferie. Dit model is gebruikt om HIV-infectie en latency 5-8 bestuderen.
We hebben geleid tot een gewijzigde versie van dit model waarin we genetisch gemodificeerde gebruiken humane hematopoietische stamcellen (hHSC) aan de thy / liv implantaat gevolgd door injectie van getransduceerde autologe hHSC 7, 9 construeren. Deze benadering resulteert in het genereren van genetisch gemodificeerde lijnen. Belangrijker we aangepast dit systeem de mogelijkheid van het genereren functionele cytotoxische T cellen (CTL) expressie brengen van een melanoom specifieke T-cel receptor onderzocht. Met dit model konden we de functionaliteit van onze transgene CTL gebruik levende positron emissie tomografie (PET) beeldvorming tot tumorregressie (9) vast te beoordelen.
Het doel van dit protocol is het beschrijven van het proces van het genereren van deze transgene muizen en beoordelen van in vivo resultaten met behulp van live PET-beeldvorming. Als een notitie, omdat we gebruik maken van menselijke weefsels en lentivirale vectoren, onze faciliteiten voldoen aan CDC NIH richtlijnen voor Bioveiligheid Niveau 2 (BSL2) met speciale voorzorgsmaatregelen (BSL2 +). Bovendien de NSG muizen ernstig zijn dus immuungecompromitteerde moeten hun behuizing en onderhoud aan de hoogste gezondheidsnormen ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
De gewijzigde BLT gehumaniseerd muismodel combinatie met in vivo PET beeldvorming zijn krachtige hulpmiddelen om chronische ziekten bij de mens te bestuderen. Dit systeem neemt de BLT muismodel en verbeteringen die zij buiten de beperkte ruimte voor HIV-onderzoek. Bovendien is een groot systeem waarin we onderzoeken verschillende gentherapie en diagnostische technieken voordat ze de klinische instelling bereikt. Deze laatste combinatie met de lage kosten van het gebruik muizen versus primaten maakt dit een zeer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Alvin Welch en Larry Pang bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd deels gefinancierd door de National Institutes of Health (NIH) award P50 CA086306, het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) subsidies RC1-00149-1 en RS1-00203-1; CIRM New Faculty Award RN2-00902-1 , de Caltech-UCLA Joint Center for Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, de UCLA Aids Institute, de CIRM Hulpmiddelen en Technologie Award RT1-01126, en de UC Multicampus Research Program en initiatieven van de California Centrum voor Antivirale Drug Discovery (aantal MRPI-143.226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
