Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma
Summary
Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.
Abstract
Fare gibi küçük hayvan modellerinde yaygın insan hastalığı araştırmak için ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için kullanılmıştır. Bilgi zenginliği bu çalışmalarda elde rağmen, fare bağışıklık yanı sıra insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu gibi viral hastalıkların türlerin özgüllüğü benzersiz özellikleri insanlaşmış fare modellerinin gelişmesine yol açmıştır. Önceki modellere C. B 17 SCID / SCID farelerde ve adlandırdığı insan fetal timus ve fetal karaciğer transplantasyonu kullanımı dahil senin / liv (SCID-hu) 1, 2 ya da insan periferik kan lökositleri evlatlık transferi (SCID-huPBL ) 3. Her iki model de ağırlıklı olarak HIV enfeksiyonu çalışma için kullanılmıştır.
Bu modellerin her ikisi de temel sınırlamalar biri onları HIV hastalığı araştırmak için daha önemli fizyolojik modeli yapmak için çevre, insan bağışıklık hücrelerinin kararlı sulandırma eksikliği oldu. Bu amaçla, BLT uğultuanized fare modeli geliştirilmiştir. BLT kemik iliği / karaciğer / timus anlamına gelir. Bu modelde, 6 ila 8 hafta eski NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG), bağışıklığı baskılanmış farelerde ikinci bir insan hematopoetik kök hücre nakli 4 tarafından takip edilmesi sadece SCID-hu fare modelinde olduğu gibi senin / liv İmplantı alacak. Bu sistemin avantajı, çevre, insan bağışıklık sisteminin tam sulandırılması olduğunu. Bu model, HIV enfeksiyonu ve gecikme 5-8 incelemek için kullanılır olmuştur.
Biz genetik hHSC 7, 9 otolog transduced enjeksiyonu takiben thy / liv implant oluşturmak için insan hematopoietik kök hücreleri (hHSC) modifiye kullanımı olan bu modelin değiştirilmiş bir versiyonunu yarattı. Bu yaklaşım, genetiği değiştirilmiş soy nesil sonuçlanır. Daha da önemlisi, bir melanom spesifik T hücre reseptörü eksprese eden fonksiyonel sitotoksik T hücreleri (CTL) oluşmasına neden incelemek için bu sistem uyarlanmış. Bu modelini kullanarak tümör regresyonu (9) belirlemek için canlı pozitron emisyon tomografi (PET) görüntüleme kullanarak bizim transgenik KVK işlevselliğini değerlendirmek başardık.
Bu protokolün amacı bu transgenik farelerin üreten ve canlı PET kullanılarak in vivo etkinliği değerlendiren sürecini açıklamaktır. Biz insan doku ve lentiviral vektörler kullanın bu yana bir not olarak, tesislerimizde özel önlemler (BSL-2 +) ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) için CDC NIH yönergelere uygun. Buna ek olarak, NSG farelerde ciddi nedenle bağışıklığı baskılanmış, onların barınma ve bakım en yüksek sağlık standartlarına (uymalıdır http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo PET görüntüleme ile birleştiğinde modifiye BLT humanize fare modelinde kronik insan hastalıkları incelemek için güçlü araçlardır. Bu sistem blt fare modeli ve HIV araştırma için sınırlı kapsamı dışındadır gelişmeler alır. Buna ek olarak, bunların klinik ortamda ulaşmadan önce çeşitli gen tedavi protokolleri gibi teşhis yöntemleri incelemek hangi bir büyük bir sistemdir. Fareler karşı primatlar kullanarak düşük maliyet ile birleştiğinde ikincisi bu bir ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların teknik yardım Alvin Welch ve Larry Pang teşekkür etmek istiyorum. CIRM Yeni Fakülte Ödülü RN2-00902-1; Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ödülü P50 CA086306, Rejeneratif Tıp California Institute (CIRM) hibeler RC1-00149-1 ve RS1-00203-1 tarafından kısmen finanse edildi , Translasyonel Tıp Caltech-UCLA Ortak Merkezi, AIDS Araştırma için UCLA Merkezi'nde (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Enstitüsü, CIRM Araçlar ve Teknoloji Ödülü RT1-01126, ve UC Multicampus Araştırma Programı ve California Girişimleri Antiviral İlaç Keşif Merkezi (sayı MRPI-143226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
