Summary

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Published: July 01, 2011
doi:

Summary

Эта статья представляет проточная цитометрия основе метод для исследования иммунного состав аорты. Документ также показывает дополнительную технику, которая позволяет изучения окружающих и адвентиции стенки сосуда отдельно. Этот метод открывает возможности для выполнения фенотипических анализов аорты лейкоцитов и применить несколько иммунологических анализов для исследования атеросклероза.

Abstract

Атеросклероз является хроническим воспалительным процессом среднего и большого размера судов, которое характеризуется образованием бляшки, состоящие из пены клетки, клетки иммунной системы, сосудистых эндотелиальных и гладкомышечных клеток, тромбоцитов, внеклеточного матрикса и богатых липидами ядро ​​с обширным некрозом и фиброз окружающих тканей. 1 врожденного и адаптивного руки иммунном ответе принимают участие в инициировании, разработке и настойчивость атеросклероза. 2, 3 Существует значительное количество доказательств того, что различные подмножества иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, Т-и В-лимфоцитов, присутствуют в пределах здоровых аорты и атеросклероз подверженных мышей 4. Кроме того, клетки иммунной системы находятся в окружающем аорты адвентиции что предполагает важную роль этой ткани в атерогенеза 2.

В течение некоторого времени, количественного определения различных типов иммунных клеток, их статус активации и клеточного состава в стенке аорты была ограничена RT-PCR и иммуногистохимических методов исследования атеросклероза. Мало были предприняты попытки выполнить проточной цитометрии с использованием человеческой аорты, а также ряд проблем, таких как высокая аутофлюоресценция, были зарегистрированы 5,6. Человек атеросклеротических бляшек переваривали коллагеназы 1, а свободные ячейки были собраны и окрашены для CD14 + / + CD11c выделить макрофагами клеток, полученных из пены. В этом исследовании, "ложный" канал используется, чтобы избежать ложноположительных окрашиванию. 6 некротические материалов накапливается в процессе пищеварения приводят в большое количество мусора, который генерирует высокий аутофлюоресценция в аорте образцов. Чтобы решить эту проблему, группа отрицательный и положительный контроли была предложена, но только двойного окрашивания могут быть применены в этих образцах. Мы разработали новый проточной цитометрии Метод, основанный 7 для анализа иммунных клеточного состава и характеризуют активации, пролиферации, дифференцировки клеток иммунной системы у здоровых и атеросклероза подверженных аорты. Этот метод позволяет исследовать иммунную состав ячейки стенки аорты и открывает возможности использования широкого спектра иммунологические методы исследования иммунной аспекты этого заболевания.

Protocol

1. Выделение мышиной аорты Институциональный комитет IACUC утверждении процедуры, необходимые для работы с мышами. Подготовка heparinzed PBS путем добавления 1000 единиц гепарина натрия до 50 мл PBS и обращения трубки перемешать. Подготовка пустые трубки коллекцию для крови и ?…

Discussion

Здесь мы представляем потока цитометрии Метод, основанный на исследовании иммунного клеточного состава мышиных аорты. Основным преимуществом этого метода является способность анализировать аорты иммунных клеток на одном уровне клеток и, чтобы охарактеризовать состояние активации ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта: PO1 HL55798 (в КЛ) и Американской кардиологической ассоциации ученых грантов на цели развития 0525532U (Е. Г.).

Materials

Material Catalog Number Company
Collagenase XI C7657 Sigma-Aldrich
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
DNase I, type 2 D4527 Sigma-Aldrich
Collagenase I C0130 Sigma-Aldrich
Collagenase II LS004174 Worthington Biochemical Corporation
Elastase LS002292 Worthington Biochemical Corporation

References

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
  2. Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
  3. Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
  4. Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
  5. Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
  6. Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a “mock” FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
  7. Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
  8. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
  9. Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
  10. Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848, doi:10.3791/2848 (2011).

View Video