De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.
Genetische informatie gecodeerd door DNA is georganiseerd in een complexe en sterk gereguleerd chromatine structuur. Elk chromosoom is gevestigd in een bepaald gebied, die kunnen veranderen afhankelijk van stadium van ontwikkeling of celcyclus. Genexpressie kan optreden in de gespecialiseerde transcriptionele fabrieken waar chromatine segmenten kunnen lus uit verschillende chromosoom gebieden, wat leidt tot co-lokalisatie van DNA segmenten die kunnen bestaan op verschillende chromosomen of ver van elkaar op hetzelfde chromosoom. De Associated Chromosome Trap (ACT) assay is een effectieve methodiek om deze lange afstand DNA verenigingen in een onpartijdige wijze te identificeren door uitbreiding en wijziging van het chromosoom bouw vast te leggen techniek. De ACT-test maakt het mogelijk voor ons om te onderzoeken mechanismen van transcriptionele regulatie in trans, en kunnen helpen verklaren de relatie van nucleaire architectuur tot gen expressie in normale fysiologie en tijdens de ziekte staten.
Dekker et al.. Ontwikkelde het chromosoom exterieur capture (3C) benadering van de frequentie van de interactie tussen twee genomische loci een te detecteren, en 3C is uitgebreid gebruikt voor het intra-chromosomale en inter-chromosomale associaties te onderzoeken tussen twee bekende DNA-regio's in zoogdiercellen 2 -9. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie 10-11. We hebben deze aanpak gewijzigd naar onbekende DNA-regio's die zijn gekoppeld aan een bekende DNA-regio in gekweekte muizen en menselijke cellen (figuur 1) te identificeren. We noemde deze methode de bijbehorende chromosoom val (ACT) test, want het heeft ons een betrouwbare en reproduceerbare methode om nieuwe onbekende DNA-partners die associëren met een bekende doel-DNA regio 12 te identificeren. Een succesvolle test met 3C nodige controles wordt uitgevoerd vóór het uitvoeren van de nieuwe aspecten van het ACT-test 13. Om tofind zo veel geassocieerd DNA regio's mogelijk te maken, is het noodzakelijk om verschillende combinaties van eerste en tweede restrictie-enzymen te gebruiken. Het is vooral belangrijk om restrictie-enzymen die ongevoelig zijn voor CpG methylering om de eerste 3C ligatie stap uit te voeren. De eiwitbinding en DNA-methylering kan ook van invloed zijn restrictie-enzym vertering efficiency en kan leiden tot het falen van ligatie van de bijbehorende DNA-regio's voor bepaalde restrictie-enzym ontsluitingen. Het optreden van intra-of inter-chromosomale ligatie is afhankelijk van eiwit-DNA cross-linking en passende fysieke kaarten van zowel van de bijbehorende DNA-regio's. Zo, enkele voorlopige experimenten zijn essentieel voor een effectieve praktisch formaldehyde concentratie en de duur van de behandeling te vestigen in de ACT-test. Een reeks van de uiteindelijke concentratie van formaldehyde (from1.5% tot 2%) werden gebruikt in verschillende labo's tijdens de 3C gedeelte van de test 7,9. Als alternatief kan de oligonucleotiden gebruikt als linkers worden ontworpen om het cohesieve uiteinde gesneden door de tweede restrictie-enzym wedstrijd. Hoewel wij vonden dat 18 tot 20 cycli in de eerste ronde van PCR en 20-25 cycli in de tweede ronde van PCR kon duidelijk bands te bieden, is het noodzakelijk om vast te stellen de beste PCR-condities voor elk experiment (figuur 2). Intra-molecuul gloeien tussen 5'-uiteinde en het 3'-uiteinde complementaire adapter sequentie van een DNA-streng kan optreden in PCR, het remt adapter-specifieke primer annealing met het DNA-molecuul, en resulteerde in veel lagere amplificatie-efficiëntie in de eerste paar cycli. Nadat het doel-DNA werd geamplificeerd voor cycli, kan het bedrag veel groter zijn dan deze niet-specifieke reacties, en kan de concurrentie van primer annealing om het doel DNA-moleculen te vergemakkelijken. Dat is ook de reden waarom wij achtergrond versterking te zien, en waarom de eerste ronde PCR-product moet worden verdund op de achtergrond amplification.It daling is het van belang om overtollig primers te verwijderen uit het PCR-reactie om de achtergrond daling in de tweede ronde van PCR. Zoals in alle PCR-gebaseerde experimenten, is het essentieel om het ontwerp primers die zich niet bevindt in herhaling reeks regio's, die de meerderheid van mens en muis DNA vormen. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie.
The authors have nothing to disclose.
We danken Adelle Murell en Wolf Reik hartelijk voor het delen van hun 3C protocol. Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie en de Research Service van het Department of Veterans Affairs.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |