장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

1. 장거리 염색질 상호 작용의 포름 알데히드 고정 인큐베이터에서 15% FBS 및 80-90%의 합류 1 X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 문화 인간의 세포 라인 RPMI1640 매체 HL – 60, 37에서 5 % CO 2와 함께 제공된 ° C. 15 분 동안 1,200 rpm으로 50 ML Nunc 튜브, 원심 분리기로 세포를 수집하고 열망하여 미디어를 제거 셀 알약을 resuspend하고 hemocytometer를 사용하여 셀을 카운트하는 문화 매체의 5 ML을 추가합니다. RPMI1640 / 10 % FBS 40 ML의 볼륨에 약 1 X 10 7 세포를 가지고, 다음 희석 염색질를 해결하기 위해 37 % 포름 알데히드의 1.7 ML를 추가합니다. 부드러운 잡고 10 분 동안 상온에서 품어, 그리고 2M 글리신의 2.4 ML로 끄다. 4 1,200 rpm으로 15 분 동안 원심 분리기는 ° C, 그리고 표면에 뜨는를 제거합니다. 40 ML 얼음 차가운 PBS로 한번 펠렛을 세척 후 펠렛를 스핀 다운하고 PBS를 제거합니다. 2. 핵을 분리하기 위해 셀 용해 갓 추가 테아제 억제제 (1:500 희석)와 0.1 MM PMSF 얼음 차가운 용해 완충액 (10 MM 트리스 – HCL, pH8.0, 10 MM NaCl, 0.2 % NP – 40) 40 ML에 Resuspend 세포. 90분, 15 분 동안 2,500 rpm으로 원심 분리기에 대한 회전 추운 방에 부화하고, 표면에 뜨는를 제거합니다. 3. Bgl II와 제한 효소 소화 1 X 코 버퍼 3 0.5 ML의 핵 Resuspend, 15 μlof 10% SDS를 추가합니다. 잡고 1 시간 동안 37 ° C에서 부화 후, 트리톤은 X – 100 SDS를 격리 20 % 45 μl를 추가합니다. ° C 1 시간 잡고 37 알을 품다. 제한 효소 분해 1 X 10 6 핵 (15 μg, 원래 셀은 10 분의 1)의 나누어지는을 사용합니다. 단계 3.1에서 핵 솔루션 55 μl를 꺼내 1 X 코 버퍼 3 Bgl II (50U/ul) 12 μl의 433 μl 500 μl까지합니다. ° C 하루 37 알을 품다. 4. 상호 작용하는 DNA 세그먼트의 결합 65 가열하여 95 10% SDS의 μl 및 변성을 추가 ° 물을 욕조에 20 분 C.하여 제한 효소를 Inactivate 하나의 X 내고 버퍼 (30 MM 트리스 – HCL, pH를 8.0, 10 MM MgCl 2, 10 MM DTT, 1 MM ATP) 20 % 트리톤 X – 100 360 μl 7 ML 추가 1 시간 동안 ° C 37 알을 품다 . 16 온도를 낮게 ° C 400 U / μl T4 DNA ligase의 50 μl를 추가합니다. 30 분 실온에서 다음 4 시간 동안 16 ° C에서 샘플을 품어합니다. 5. DNA의 정제 proteinase K 300 μg을 추가하고, ° C 야간 65 알을 품다. 37과 부화 ° C 30 분 RNase의 5 μg 추가 이소프로판올에 페놀 / 클로로포름 추출 및 침전의 DNA에 의해 DNA 정화. 멸균 증류수 150 μl의 DNA를 디졸브. 6. MSP I과 소화와 oligonucleotide linkers과 결합 4-6시간에 대한 37 MSP I 5 단위 ° C를 DNA를 정화의 2μg을 품어. 65 I를 MSP Inactivate ° 10 분 C는 다음 5 MG / ML 글리코겐 1 μl와 에탄올의 DNA를 침전. 멸균 증류수 50 μl의 DNA 펠렛을 디졸브. 20 μm의 링커 oligonucleotide의 L 2 μl와 MSP I – 대우 DNA의 50 μl를 혼합 (5' – gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac – 3 '), 20 μm의 oligonucleotide S (5' – cggtgaatc – 3 1 μl'), 1 μl 무균 증류수 10 X T4 DNA ligase의 버퍼 6 μl. 액체 왁스와 혼합을 커버. 50 변성 oligonucleotides ° C 1 분, 10 점차 진정 수에 대한 ° C 온도 자전거 타는 사람에서 0.5 ° C / 분 그라데이션 인치 400 U / μl T4 DNA ligase의 1 μl를 추가하고 15 ° C 하룻밤에 품어. 링커 – 출혈도 잡았 QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 DNA와 멸균 증류수 50 μl에 elute 정화. 7. PCR 증폭 및 시퀀스 분석 당신이 장거리 상호 작용 (즉, '미끼')에 대한 검토하고자하는 DNA의 특정 지역에 대한 입문서를 선택합니다. 이 예제에서, 우리는 ABL – 1을 사용합니다. 20 μm의 1 μl를 사용하여 첫 라운드 PCR ABL -1 특정 프라이머 # 4656 (5' – gttcaagcgattctcctgcctcga – 3 '), 20 μm의 1 μl 링커 특정 프라이머 # 2963을 (수행할 수있는 정화 DNA 1 μl을 가지고 5' – 3 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일과 멸균 증류수 3 μl의 gctgaccctgaattcgcacgtgcct – 3 '), 3μl. 32 P – dCTP 두 μl는 PCR 증폭하기 전에 세 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일 100 μl에 추가됩니다. 95 18 사이클 ° 20 초 동안 C, 65 ° 40 초전에 C, 72 ° C 1 분,, 마지막 확장자 핫 시작 PCR에 대한 열 사이클 72 ° 2 분, 95 C ° Cfor 이분입니다 72에서 수행됩니다 ° C5 분. 멸균 증류수 30 μl에 QIAquick PCR의 정화 키트 및 elute DNA를 사용하여 첫 라운드 PCR 제품 정화. 20 μm의 1 μl ABL – 1 특정 프라이머 # 4626 (5' – ggagaatttttatctgcctctgtga – 3 ') (그림 1A), 1 μl를 추가하여 중첩 primers를 사용하여 PCR의 두 번째 라운드를 수행하는 첫번째 PCR 제품을 희석 100 X 1 μl을 가지고 링커 특정 프라이머 # 2961 (5' – gtcgttagcggacacagggcgattc – 3 '), 멸균 증류수의 μl 3 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일과 3 개 중 3 μl의 20 μm의 중. 온도 사이클링 일정가 95의 25주기입니다 ° 20 초 동안 C, 67 ° 40 초전에 C, 72 ° C 5 분 72 ° C에서 확장하여 다음 1 분하십시오. 5 % 우레아 페이지 젤을 실행하고 PhosphoImager에 노출된 화면 (그림 1B)를 스캔하여 PCR 제품을 시각화. 각 PCR 밴드가 멸균 증류수 60 μl를 포함 Eppendorf 튜브에 겔 스트립을 해소하고, ° C 5 분 95시 잠복기에 의해 겔에서 재활 용할 수 있습니다. 모든 샘플을 수집하기 위해 10 초 10,000 rpm으로 간단히 원심 분리기. 위에서 설명한 것과 같은 조건을 사용하여 뇌관의 페어 4,626분의 2,961로 PCR을 수행하기 위해 DNA를 템플릿으로 사용하여 1 μl를 제거합니다. 시퀀스 분석 QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 정제 후 수행할 수 있습니다. http://genome.ucsc.edu (그림 1C) : DNA 시퀀스는 웹 사이트에서 자신의 염색체 위치를 결정하는 온라인 도구를 사용하여 분석하고 있습니다. DNA 시퀀스를 붙여넣을 수있는 새 창을을 입력하려면 'BLAT'을 클릭, 새로운 윈도우 '제출'을 클릭 후 나타나는, 그리고 'BLAT 검색 결과'를 보여줍니다. DNA 순서의 위치를​​ 보여주기 위해 다음 창문을 입력 100 % 신분으​​로 조회를 클릭한 다음 '브라우저'. 8. 대표 결과 1. 긴 범위의 DNA 상호 작용을 결정 미끼로 ABL – 1 영역을 사용하여 ACT 분석 그림 1A, 두 Bgl II 사이트 하나 BamH I 사이트의 그림은 ACT 분석을 위해 선택되었다. PCR의 두 번째 라운드에서, 뇌관은 2,961분의 4,626이 ABL – M1을 증폭하는 데 사용된 설정 2,961분의 4,630은 ABL – M2 사용되었고, 2,961분의 4,636은 ABL – M3를 위해 사용되었다. 전형적인 겔 패턴은 여러 밴드 (그림 1B) 하나 보여줍니다. ACT의 분석에서 각 조각은 두 결합 DNA 세그먼트로 구성되어 있습니다 : 두 번째 세그먼트가 첫 번째 제한 효소 인식 시퀀스로 미끼 지역 세그먼트에 합류했습니다 관련된 파트너에서 제공하는 동안 한 세그먼트는 미끼의 DNA 지역에서 파생됩니다. 두 번째 효소 인식 시퀀스 관련된 파트너 순서 (그림 1C)의 끝 부분에 표시됩니다. 복제된 ABL – M1 조각 +133,592,306-133,592,399에서 염색체 9q32.4에 위치한 ABL1의 지역에서 DNA를 포함하고, 관련된 파트너는 +71,869,882-71,870,107에서 염색체 3p13에 위치하고 있습니다. 관련된 파트너의 신원은 UCSC 게놈 브라우저 (월 출시 GRCh7/hg19 2009)를 사용하여 자신의 시퀀스를 분사에 의해 발견됩니다. PROK2는 chr3p13 로커스에 관련된 파트너로 확인되었다. 클론 ABL – M3가 ABL – 1 로커스 근처 내부 염색체 연관로 식별하는 동안 마찬가지로, ABL – M2 관련된 파트너는 chr5q21.1로 지역화된되었습니다. 2. ACT의 분석을 사용하여 적은 유행 원거리 상호 작용을 결정 3C에 따라 다른 assays 우리는 그림 1과 Igf2 / H19 로커스 12 보였습니다보다 많은 상호 작용하는 파트너를보고있다. 우리가 설명해야하는 방법론은 가장 널리 원거리 상호 작용을 선택합니다. 그러나, PCR 사이클의 수를 늘림으로써, 그것은 추가로, 덜 자주 연관을 식별할뿐만 아니라 (그림 2) 수 있습니다. 3. 정상 조직에 비해 암세포에 긴 범위 상호 작용의 차이. ACT의 분석도 정상 세포와 암세포 (그림 3) 사이의 핵 구조의 차이와 원거리 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 셀 변환하는 동안 발생하는 핵 구조의 변화를 반영 수 있으며, 따라서이 분석은 궁극적으로 진단 목적으로 적용할 수 있습니다. 정상 및 암 조직 모두에서 발생하는 유사한 겔 패턴 ACT 분석은 안정적이고 반복이라고 지적했다. ACT의 분석은 피시 앤 칩의 assays 같은 장거리 DNA 파트너, 자세한 분석, 멀리 loci 간의 식별 협회의 존재를 확인하는 데 필요한을 식별할 수 있지만. 유전, 생리학 및 생화학 연구는 다음이 장거리 DNA 협회의 생물 학적 의미를 명료하게하다을 수행할 수 있습니다. HL – 60 세포에서 DNA 미끼로 ABL – 1 영역을 사용하여 그림 1 ACT 분석. A. DNA의 구조체ABL – 1 지역에 우레. ACT 분석에 사용되는 첫 번째 제한 효소 Bgl II되었습니다. PCR의 두 번째 라운드에 대한 primers도 화살표와 해당 뇌관 번호로 표시됩니다. B. 5% 요소 페이지에서 ACT 분석의 젤 형태. 프라이머 쌍 2,961분의 4,626이 중첩된 PCR에 ABL – M1 클론을 확장에 사용 되었음 2,961분의 4,630은 클론 ABL – M2 사용되었고, 2,961분의 4,636은 복제 ABL – M3를 위해 사용되었다. C. 클론 ABL – M1의 DNA 시퀀스. ABL – 1 미끼 DNA의 DNA 단편은 빨간색으로 표시하고, 연관된 DNA 파트너는 시안에 표시됩니다. Bgl II 사이트 (AGACTC)은 녹색으로 표시되었습니다이며, MSP I 사이트 (CCGG)은 자주색으로 표시됩니다. 그림 2 PCR 사이클 행동 분석 결과에 영향을 미칩니다. 마우스 fibroblast 세포에서 미끼의 DNA로 Igf2/H19 로커스에서 각인 제어 영역 (ICR)을 사용하여 다양한 자전거 프로그램은 ACT 분석에서 PCR의 첫 번째와 두 번째 라운드에 적용되었습니다. PCR의 첫 라운드에서 18-20 사이클 시각있을 정도로 신호를 증폭하지 않았다. 분명 밴드의 두 번째 PCR 결과에서 스물 다섯 사이클, PCR의 두 번째 라운드를위한 사이클의 수를 증가하면서 더 밴드 이외에 얼룩 패턴을 유도. 그림 ACT 분석에서 정상적인 결장 조직 및 결장암 조직 사이의 핵 구조의 차이 3 탐지. A. IGF2/H19 로커스과 IGF2 유전자의 ICR 지역의 DNA 구조를. ACT 분석을위한 Dpn II 사이트가 표시됩니다. 두 번째 라운드에 사용되는 PCR Primers는 그림의 패널 B의 각 차선에 해당하는 다양한 색상의 화살표와 숫자로 표시됩니다. B. 5% 요소 페이지에서 ACT 분석의 젤 형태. 정상 대장 조직 MAD03 – 1423 및 결장암 조직 MAD04 – 149은 협동 조합 인체 조직 네트워크 (CHTN) 서부 본부로부터 얻은 것입니다. 각 결장 조직을 균질 후, ACT 분석은 여기에서 설명하는 절차는 다음과 같은 수행되었다. 레인 1은 프라이머 쌍에게 패널에 분홍색으로 표시 # 2961and # 4161 (5' – tctgcgccatcagggcagtgagac – 3 ')를 사용하여 PCR 결과를 나타내고, 차선 2 프라이머 쌍에게 # 2961과 # 4163 (5' – gccgcgcggccacttccgattcc – 3를 사용하여 PCR 결과를 나타냅니다 ')가 패널에 오렌지색으로 표시, 차선 3 뇌관 쌍을 # 2961과 # 5145 (5' – gccatgcaggtaggatttgagctg – 3를 사용하여 PCR 결과를 나타내는'패널에서 파란색으로 표시)을, 차선 4 뇌관 쌍을 # 2961를 사용하여 PCR 결과를 나타냅니다 와 # 5151 (5' – gtctcaaataggggccagctagcttgg – 3 ') 패널 A에서 녹색으로 표시 정상적인 결장 조직에서만 나타나는 고유 밴드는 노란색 화살표로 표시되며, 결장 암 조직에서만 나타나 그 밴드는 빨간색 화살표가 표시됩니다. ICR, 각인 통제 지역, DMR, 다른 methylated 지역.