Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак
Summary
Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.
Abstract
Резус-макаки модель в настоящее время наилучшие имеющиеся модели для ВИЧ-СПИД в отношении понимания патогенеза, а также для разработки вакцин и методов лечения<sup> 1,2,3</sup>. Здесь мы опишем метод подробную фенотипические и функциональный анализ клеточных иммунных реакций, в частности, внутриклеточное продукцию цитокинов CD4 + и CD8 + Т-клеток, а также отдельные подмножества памяти. Мы получили точные количественные и качественные показатели для производства гамма-интерферона (ИФН) и интерлейкин (IL) -2 в CD4 + и CD8 + Т-клеток от резус-макаки РВМС стимулированных PMA плюс иономицина (PMA + I). Цитокинов профили были различными в разных подмножествах ячеек памяти. Кроме того, данный протокол дает нам чувствительность, чтобы продемонстрировать даже незначительные доли антиген специфических CD4 + и CD8 + Т-клеток подмножества в РВМС образцы из макак-резус, иммунизированных пептидом ВИЧ конверт коктейль вакциной, разработанной в нашей лаборатории. Цитометрии многоцветной поток техника представляет собой мощный инструмент, чтобы точно определить различные популяции Т-клеток<sup> 4,5</sup> С цитокин-производственные мощности<sup> 6</sup> Следующий неспецифические или антиген-специфической стимуляции<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Доктор Прамод Nehete и миссис Bharti Nehete для макаки крови и РВМС образцов; Эта работа была частично поддержана за счет средств гранта NIH А.И. 46969, и все средства массовой информации культуре клеток были произведены Центральной Media Laboratory, которая финансируется за счет гранта NIH CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
