アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析
Summary
我々は、合計だけでなく、アカゲザルのCD4 +とCD8 + T細胞、HIV /エイズワクチン研究のための理想的なモデルのメモリのサブセットの詳細な表現型と機能解析のための多色フローサイトメトリーの有用性を実証する。
Abstract
アカゲザルのモデルは、ワクチンや治療薬の開発のためだけでなく、病態の理解に関して、現在HIV – AIDSのための最善の利用可能なモデルです<sup> 1,2,3</sup>。ここで、我々は、細胞性免疫応答の詳細な表現型および機能解析、CD4で特に細胞内サイトカイン産生+およびCD8 + T細胞だけでなく、個々のメモリのサブセットのための方法を説明します。我々は、インターフェロンγ（INF -）とインターロイキン（IL）CD4 +とCD8の両方で-2 PMAプラスイオノマイシン（PMA + I）で刺激したアカゲザルPBMCから+ T細胞の生産のための正確な定量的および定性的な措置を得た。サイトカインプロファイルは、メモリセルの異なるサブセットに異なっていた。さらに、このプロトコルは、我々の研究室で開発されたHIVエンベロープペプチドのカクテルのワクチンで免疫したアカゲザルからPBMCサンプル中に抗原特異的CD4 +およびCD8 + T細胞サブセットの些細な分画を示すために感度を提供する。多色フローサイトメトリー法は、T細胞の異なる集団を正確に識別するための強力なツールです。<sup> 4,5</sup>サイトカイン産生能力を持つ<sup> 6</sup>非特異的または抗原特異的刺激後<sup> 5,7</sup>。
Protocol
1）細胞調製と抗原刺激、2）表面マーカーの染色、3）細胞内サイトカイン染色、4）フローサイトメトリー：合計だけでなく、T細胞のメモリーのサブセットの詳細な表現型および機能解析のための手続は、4つの部分に分けることができます。分析。 1。細胞調製と抗原刺激両方たての分離だけでなく、凍結保存された末梢血単核細胞（PBMC）は、このプロトコルで…
Acknowledgements
マカク血とPBMCサンプルの博士PramodさんNehete夫妻バーティNehete、この作業は、部分的にNIHの助成金AI 46969からの資金によって支えられて、そしてすべての細胞培養培地は、中央メディア研究所で生産され、NIHの助成CAによって資金を供給され16672。
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
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Citer Cet Article
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).