تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي
Summary
نحن لشرح فائدة التدفق الخلوي متعدد الألوان مفصلة عن توصيف المظهري والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الذاكرة CD4 + CD8 + وخلايا T في المكاك وهو قرد اسيوي ، والنموذج المثالي لإجراء دراسات لقاح فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.
Abstract
النموذج المكاك ريسوس حاليا أفضل نموذج المتاحة لمكافحة فيروس الإيدز فيما يتعلق بفهم المرضية فضلا عن تطوير لقاحات وعلاجات<sup> 1،2،3</sup>. هنا ، نحن تصف طريقة لتحليلات مفصلة المظهرية والوظيفية من الاستجابات المناعية الخلوية ، وتحديدا بين الخلايا إنتاج السيتوكينات من CD4 + و + CD8 خلايا تي ، فضلا عن مجموعات فرعية الذاكرة الفردية. حصلنا على دقة القياسات الكمية والنوعية لإنتاج الإنترفيرون جاما (INF) وانترلوكين (IL) -2 في كل CD4 + و CD8 + T خلايا من المكاك ريسوس PBMC حفز مع سلطة النقد الفلسطينية بالاضافة الى ionomycin (PMA + I). كانت ملامح خلوى مختلفة في مجموعات فرعية مختلفة من خلايا الذاكرة. وعلاوة على ذلك ، قدمت لنا هذا البروتوكول حساسية لإظهار الكسور ولو كانت بسيطة من المستضد CD4 + ومحددة CD8 + الخلايا التائية فرعية داخل عينات من المكاك وهو قرد اسيوي PBMC المحصنين مع لقاح مضاد لفيروس نقص المناعة البشرية المغلف كوكتيل الببتيد وضعت في مختبر لدينا. والتدفق الخلوي تقنية متعددة الألوان هي أداة قوية لتحديد بدقة مجموعات مختلفة من الخلايا T<sup> 4،5</sup> مع خلوى المنتجة للقدرة<sup> 6</sup> التالي التحفيز غير محددة أو محددة مستضد<sup> 5،7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
الدكتور برامود Nehete والسيدة Nehete بهارتي للدماء وعينات المكاك PBMC ؛ وأيد هذا العمل جزئيا من أموال منحة من المعاهد القومية للصحة رقم 46969 ، وأنتجت كل خلية ثقافة وسائل الإعلام من قبل وسائل الإعلام مختبر المركزي ، الذي تموله المعاهد الوطنية للصحة منح CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
