Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus
Summary
Nous démontrons l'utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.
Abstract
Le modèle macaque rhésus est actuellement le meilleur modèle disponible pour le VIH-sida à l'égard de la compréhension de la pathogenèse, ainsi que pour le développement de vaccins et de thérapeutiques<sup> 1,2,3</sup>. Ici, nous décrivons une méthode pour l'analyse détaillée phénotypique et fonctionnelle des réponses immunitaires cellulaires, la production de cytokine spécifiquement intracellulaire par CD4 + et CD8 + ainsi que les sous-ensembles de la mémoire individuelle. Nous avons obtenu des mesures précises quantitatifs et qualitatifs pour la production d'interféron gamma (IFN-) et l'interleukine (IL) -2 dans les deux cellules CD4 + et CD8 + T des cellules du macaque rhésus PBMC stimulées par le PMA, plus ionomycine (PMA + I). Les profils de cytokines ont été différentes dans les différents sous-ensembles de cellules mémoire. Par ailleurs, ce protocole nous a fourni la sensibilité à démontrer, même des fractions mineures de l'antigène spécifique de CD4 + et CD8 + sous-ensembles de cellules T dans les échantillons PBMC de macaques rhésus vaccinés avec un vaccin d'enveloppe du VIH cocktail de peptides développés dans notre laboratoire. La technique de cytométrie en flux multicouleur est un outil puissant pour identifier précisément les différentes populations de cellules T<sup> 4,5</sup> Avec la cytokine capacités de production<sup> 6</sup> Suite à une stimulation non-spécifique ou spécifique de l'antigène<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr Pramod Nehete et Mme Bharti Nehete pour le sang et les échantillons de PBMC de macaques; Ce travail a été partiellement financé par des fonds de NIH IA 46969, et tous les milieux de culture cellulaire ont été produites par le Laboratoire central des médias, qui est financé par le NIH octroi CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
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