Summary
Представлен пошаговый протокол изготовления аффинных сеток стрептавидина для использования в структурных исследованиях сложных образцов макромолекул методом криоэлектронной микроскопии.
Abstract
Аффинные сетки стрептавидина обеспечивают стратегии для преодоления многих часто встречающихся проблем подготовки образцов при криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), включая денатурацию образца и преимущественную ориентацию, которая может возникнуть из-за границы раздела воздух-вода. Однако сродные решетки стрептавидина в настоящее время используются несколькими крио-ЭМ лабораториями, поскольку они не являются коммерчески доступными и требуют тщательного процесса изготовления. Двумерные кристаллы стрептавидина выращивают на биотинилированном липидном монослое, который наносится непосредственно на стандартные дырявые углеродные крио-ЭМ сетки. Высокоаффинное взаимодействие между стрептавидином и биотином позволяет осуществлять последующее связывание биотинилированных образцов, защищенных от границы раздела воздух-вода, во время крио-ЭМ пробоподготовки. Кроме того, эти сетки обеспечивают стратегию концентрирования образцов, доступных в ограниченных количествах, и очистки интересующих белковых комплексов непосредственно на сетках. Здесь представлен пошаговый, оптимизированный протокол для надежного изготовления аффинных решеток стрептавидина для использования в крио-ЭМ и экспериментах с отрицательным окрашиванием. Кроме того, в комплект поставки включено руководство по устранению неполадок для решения часто возникающих проблем, чтобы сделать использование аффинити-решеток стрептавидина более доступным для более широкого сообщества крио-ЭМ.
Introduction
Электронная криомикроскопия (крио-ЭМ) произвела революцию в области структурной биологии, позволив определять макромолекулярную структуру больших, гибких и гетерогенных образцов, которые ранее были недоступны с помощью рентгеновской кристаллографии или ядерногомагнитного резонанса. Этот метод заключается в мгновенном замораживании макромолекул в растворе для создания тонкого слоя стекловидного льда, который впоследствии можно визуализировать с помощью электронного микроскопа. В последние годы значительные достижения как в аппаратном обеспечении микроскопа, так и в программном обеспечении для обработки изображений еще больше расширили типы образцов, пригодных для определения структуры с высоким разрешением с помощью крио-ЭМ.
Тем не менее, подготовка тонких витрифицированных образцов остается одним из наиболее важных этапов определения структуры макромолекул с помощью крио-ЭМ. Биологические образцы часто динамичны, хрупки, склонны к денатурации, а иногда доступны только в небольших количествах для крио-ЭМ исследований. В процессе блоттинга эти частицы взаимодействуют с гидрофобной границей раздела воздух-вода, что может привести к предпочтительной ориентации частиц, разборке хрупких комплексов, частичной или полной денатурации образца и агрегации 2,3,4. Использование детергентов или других поверхностно-активных веществ, химическая сшивка и адсорбция образцов для поддержки слоев являются распространенными стратегиями сохранения биологических образцов в процессе замораживания. Поддерживающие слои, такие как оксид графена 5,6,7 или аморфный углерод8, также служат для концентрации частиц в сетке путем адсорбции, когда образец доступен в ограниченных количествах. Однако эти методы не являются универсальными или надежными, а оптимизация подготовки сетки может быть чрезвычайно трудоемкой или вообще потерпеть неудачу.
Для преодоления этих недостатков и обеспечения мягкого и общеприменимого метода секвестрации интересующего комплекса и защиты его от границы раздела воздух-вода были разработаны аффинные сетки стрептавидина 9,10. В этих сетках используется двумерная (2D) кристаллическая решетка стрептавидина, выращенная на монослое биотинилированных липидов на сетке. После того, как сами образцы будут биотинилированы (часто редко и случайным образом, то есть в среднем по одному биотину на комплекс), их можно наносить на сетку, покрытую стрептавидином. Поскольку адсорбция образца зависит от чрезвычайно высокого сродства между стрептавидином и биотином, с этими сетками можно использовать концентрацию образца до 10 нМ. Коммерчески доступные наборы для биотинилирования белков и биотинилированные праймеры для ДНК-содержащих комплексов позволяют относительно легко прикреплять необходимые фрагменты биотина к большинству интересующих образцов. В дополнение к концентрированию образца и удержанию его подальше от повреждающей границы раздела воздух-вода во время блоттинга, случайное биотинилирование одного или нескольких остатков лизина может значительно улучшить диапазон ориентаций интересующей молекулы на крио-ЭМ сетке, как показано в ряде исследований11. Несмотря на то, что сигнал от лежащего в основе кристалла стрептавидина присутствует в необработанных изображениях, схемы обработки данных, включающие фурье-фильтрацию резких брэгговских отражений от кристалла, могут быть легко удалены во время ранней обработки данных, что в конечном итоге позволяет реконструировать интересующий образец с высоким разрешением 11,12,13. Здесь предусмотрен оптимизированный пошаговый протокол для надежного получения аффинных решеток стрептавидина и последующего использования в крио-ЭМ экспериментах. Ожидается, что представленный протокол будет завершен в течение 2 недель (рисунок 1А). В первых частях протокола описывается приготовление реагентов, предварительная обработка решеток и первые этапы испарения углерода. Далее описана инструкция по приготовлению липидного монослоя и выращиванию кристаллов стрептавидина на ЭМ-сетках. Кроме того, приведены инструкции по использованию аффинных сеток стрептавидина в экспериментах с отрицательным окрашиванием ЭМ и крио-ЭМ. Наконец, предусмотрены процедуры удаления сигнала стрептавидина с микрофотографий после получения данных крио-ЭМ.
Protocol
1. Приготовление реагентов
- Разбавляют купленный в продаже стрептавидин до конечной концентрации 0,5 мг/мл в кристаллизационном буфере (50 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, 10% трегалозы). Убедитесь, что конечная концентрация трегалозы составляет 10%. Мгновенное замораживание аликвот 25-50 мкл в жидком азоте и хранение при -80 °C.
- Растворите 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(биотинил) натриевую соль в растворителе хлороформа/метанола/воды в соотношении 65:35:8 до конечной концентрации липидов 1 мг/мл. Одноразовые аликвоты 20-30 мкл при -80 °C хранить в стеклянных флаконах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление растворителя является более точным, если оно выполняется по весу. Сначала смешайте 1,85 г сверхчистой воды с 6,41 г метанола класса высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и добавьте его к 22,42 г хлороформа для приготовления растворителя.
ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, прочтите и усвойте паспорта безопасности производителей и рекомендуемые инструкции по обращению с органическими растворителями хлороформа и метанола и их утилизации, прежде чем начинать этот протокол. Избегайте прямого контакта метанола с кожей.
2. Предварительная обработка сеток
- Промойте углеродную фольгу на золотых сетчатых решетках, дважды окунув в 100% хлороформ и один раз в 100% этанол. Положите решетки на чистую фильтровальную бумагу, чтобы они высохли. Повторите процесс стирки в общей сложности три цикла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воспроизводимый успех был достигнут с коммерчески доступными сетками из углеродной фольги, которые имеют углеродную пленку толщиной 10-12 нм (см. список материалов) с размерами отверстий в диапазоне от 0,6 до 2 мкм. Также были успешно использованы коммерчески доступные сетки из золотой фольги и самодельные дырчатые углеродные сетки, изготовленные в соответствии с протоколомнанопроизводства 14 лаборатории Рубинштейна. Менее воспроизводимые результаты были получены с коммерчески доступными сетками с более тонкими углеродными пленками. Не используйте медные сетки, так как медь вступает в реакцию с любыми органическими аминами, которые могут быть в образце. - После того, как решетки высохнут, испарите слой углерода толщиной 2,5-5 нм на углеродную сторону дырчатых углеродных решеток. Толщина углерода контролируется с помощью измерения толщины кварцевой пленки, встроенной в угольный испаритель, представленный в файле таблицы материалов .
- Дайте только что испарившемуся углероду созреть (т.е. стать более гидрофобным) в течение 1 недели.
3. Приготовление решетки стрептавидина
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выращивания 2D-кристаллов стрептавидина на дырчато-углеродных ЭМ-сетках сначала на отверстия углеродной пленки наносят биотинилированный липидный монослой (рис. 1B) методом переноса Ленгмюра-Шефера. Липидный монослой формируется после следующих этапов (рис. 2). Тальк создает границу между касторовым маслом и чашкой Петри, а тонкий слой касторового масла помогает поддерживать постоянное поверхностное давление при образовании липидного монослоя. Сторона, содержащая испарившийся углерод из стадии 2.2, используется для захвата монослоя, излишки липидов смываются кристаллизационным буфером, а раствор стрептавидина инкубируется на сетке для кристаллизации.
- Очистите место скамейки 70% этиловым спиртом.
- Промойте стеклянный шприц объемом 5 мкл несколько раз хлороформом, чтобы очистить. Перед использованием дайте шприцу полностью высохнуть.
- Решетки, испарившиеся от углерода, промойте еще раз, т. е. непосредственно перед использованием, окунув их в 100% этанол. Дайте решеткам высохнуть на чистой фильтровальной бумаге.
- Пока сетки сохнут, промойте каждый антикапиллярный пинцет 100% хлороформом и 100% этанолом. Дайте пинцету полностью высохнуть.
- На чистой стороне парапленки приготовьте три 50 мкл кристаллизационного буфера (50 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, 10% трегалозы) для каждой сетки, которая будет изготовлена.
- Заполните крышку чашки Петри диаметром 35 мм без покрытия кристаллизационным буфером (50 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, 10% трегалозы). Очистите поверхность бумагой для линз.
- Рассыпьте научный тальк по периметру чашки Петри. Впоследствии это служит индикатором того, как далеко распространилось касторовое масло. Добавьте достаточное количество талька, чтобы создать барьер, защищающий касторовое масло от прикосновения к краю чашки Петри. Добавление слишком большого количества талька ограничивает доступное пространство для создания липидного монослоя.
- Окуните наконечник пипетки объемом 200 мкл в касторовое масло, чтобы получить каплю среднего размера (примерно 20 мкл), которая свисает с наконечника пипетки. Прикоснитесь этой каплей к поверхности буфера в чашке Петри, где она растекается, образуя однородную пленку. Образующаяся тонкая пленка масла служит поршнем15, который поддерживает постоянное поверхностное давление при образовании липидного монослоя (стадия 3.10).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить достаточное количество касторового масла, а не слишком мало, и лучше добавлять одной каплей. Дайте касторовому маслу полностью распределиться, прежде чем делать липидный монослой. - Промойте стеклянный шприц объемом 5 мкл один или два раза растворенным липидом, прежде чем взять аликвоту для использования. Избегайте образования пузырьков воздуха в липиде, который заполняет шприц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянный шприц промывают растворенным липидом в случае, если после этапа 3.2 остается остаточный хлороформ. Остаточный хлороформ может повлиять на качество полученного монослоя. - Выдавите из шприца минимально возможный объем (~0,5 мкл) липида и осторожно прикоснитесь свисающей каплей к поверхности пленки касторового масла. Обратите внимание, что липидный раствор прорывается через пленку касторового масла в месте контакта и что образовавшийся липидный монослой образует круг в центре тонкой пленки касторового масла.
- Добавьте несколько капель липида последовательно или добавьте больше липида после создания нескольких сеток, но если добавить слишком много, липид распространится за границу касторового масла и по периметру, где тальк и любое загрязняющее поверхностно-активное вещество были изолированы. В этом случае процесс необходимо перезапустить.
- Подберите сетку с помощью антикапиллярного пинцета так, чтобы прямое плечо пинцета и испаренная углеродом сторона сетки были обращены к монослою.
- Перенесите часть монослоя на дырчатый углерод, прикоснувшись испарившейся от углерода стороной сетки к монослою в течение 1-2 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Об успешном переносе свидетельствует то, что поверхность сетки становится гидрофильной, в результате чего тонкая сферическая шапка буфера покрывает всю сетку после того, как она была поднята из чашки Петри. - Прикоснитесь сферическим колпачком буфера, который теперь приклеивается к сетке, последовательно в течение 1 с каждая, к трем каплям кристаллизационного буфера по 50 мкл, которые были приготовлены на парапленке на шаге 3.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе делается попытка удалить как можно больше избыточного липида, который покрывает поверхность сферического колпачка (а не ранее гидрофобную углеродную пленку), чтобы избежать образования липидных везикул при рассмотрении образцов в электронном микроскопе. - Осторожно добавьте 4 мкл 0,5 мг/мл стрептавидина в оставшийся сферический колпачок кристаллизационного буфера на сетке.
- Поместите решетку во влажную камеру. Повторите шаги 3.11-3.14 для всей партии сеток.
- Инкубируйте сетки при комнатной температуре (RT) в течение 2 ч в камере влажности, чтобы избежать испарения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы золотая сторона сетки не намокала в любой момент после нанесения монослоя. - После 2-часовой инкубации приготовьте одну 300 мкл промывочного буфера (10 мМ HEPES, pH 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, 10% трегалозы) для каждой сетки на чистой стороне парапленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочный буфер содержит 50 мМ KCl, а не 150 мМ KCl, который находится в кристаллизационном буфере, используемом для стадий 3.5-3.6. - Смойте излишки (несвязанного) стрептавидина, поместив сетку на 300 мкл капли буфера для полоскания. Выполните шаги 3.18-3.20 для одной сетки за раз. Не оставляйте решетки на 300 мкл буферной капли для промывки в течение длительного периода времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняется только одна промывка, потому что кристалл/монослой стрептавидина на этом этапе хрупкий. Каждый раз, когда сетка отрывается от поверхности промывочного буфера, жидкий мост между решеткой и каплей промывки разрывается. В момент разрыва к самонесущим монослойным кристаллам, которые охватывают открытые отверстия углеродной пленки, приложен переходный градиент давления (давление всасывания). Ожидается, что это давление всасывания вызовет временное куполообразное образование монослойного кристалла, сопровождающееся расширением области, покрытой кристаллами. Если увеличение площади превышает предел упругости кристалла, кристалл может разрушиться или стать неупорядоченным. - Немедленно высушите антикапиллярный пинцет безворсовой салфеткой, чтобы облегчить высвобождение сетки на фильтровальную бумагу на следующем шаге. Подберите сетку, плавающую на капле буфера для промывки, воткнув в каплю изогнутый рычаг антикапиллярного пинцета.
- Аккуратно промокните излишки буфера сбоку фильтровальной бумагой. Поместите сетку на фильтровальную бумагу золотой стороной вниз, повторите шаги 3.18-3.20 для каждой сетки и дайте сеткам высохнуть в течение 15-20 минут.
- После того, как сетки высохнут, переверните их так, чтобы золотая сторона теперь была обращена вверх. Испарите тонкий слой углерода (толщиной примерно 0,5-2 нм) на золотую сторону сетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните решетки при постоянной влажности, значение которой, по-видимому, не имеет значения, принимая во внимание, что многократные изменения относительной влажности, как ожидается, приведут к циклам расширения и сжатия. Дайте сеткам созреть в течение 1 недели перед использованием крио-ЭМ для достижения наилучших результатов, потому что гидрофобность обратной стороны сетки может быть важна для стабильности монослоя. Решетки стабильны в течение длительных периодов времени, но через 3 месяца задний углерод может стать менее гидрофобным.
4. Проверка качества партии аффинитиновой сетки стрептавидина по отрицательному окрашиванию
- Приготовьте две капли по 50 мкл и одну каплю по 100 мкл буфера для образца (50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,5 мМ TCEP) на чистой стороне парапленки.
- Удалите решетки трегалозы и регидрата стрептавидина, прикоснувшись к двум каплям по 50 мкл, и дайте сетке плавать на 100 мкл капли буфера образца в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше избегать использования моющего средства во время регидратации и последующей инкубации с связыванием образцов. Буфер будет рассеиваться на золотую сторону сетки и ограничивать эффективность промывок для удаления избыточных образцов. - После регидратации поднимите сетку антикапиллярным пинцетом так, чтобы изогнутый плечо антикапиллярного пинцета оказалось в капле.
- Аккуратно промокните излишки буфера сбоку и быстро повторно нанесите 4 мкл образца 75-100 нМ (опционально).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания решетки после регидратации. - Инкубируют образец во влажностной камере в течение 1-5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и время инкубации зависят от образца и должны быть оптимизированы. Указанная концентрация образца и время инкубации являются рекомендуемыми отправными точками. - На чистую сторону парапленки нанесите четыре капли по 30 мкл на буфер образца и 1% краситель уранилформиата (УФ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, прочтите и усвойте паспорта безопасности производителей и рекомендуемые инструкции по обращению с уранилформиатом и его утилизации, прежде чем выполнять этот шаг. Уранилформиат является токсичным и радиоактивным соединением. Обязательно получите предварительное одобрение учреждения на использование радиоактивного материала. - Смойте несвязанный образец, прикоснувшись к каждой из четырех капель буфера для образца.
- Окрасьте образец, используя стандартные процедуры негативного окрашивания УФ. Аккуратно промокните морилку UF сбоку, оставив на решетке очень толстый слой пятна. После промокания на сетку можно нанести дополнительно 0,5 мкл морилки, чтобы сделать пятно гуще, если это необходимо. Дайте решетке высохнуть на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку решетки из стрептавидина очень гидрофильные, негативные красители имеют тенденцию образовывать очень однородную пленку повсюду, в отличие от того, что обычно наблюдается при использовании непрерывных угольных сеток, обработанных тлеющим разрядом. В результате рекомендуется оставить более толстую пленку раствора красителя.
5. Замораживание аффинных решеток стрептавидина с биотинилированными образцами
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для одностороннего автоматизированного плунжера, содержащего внутренний датчик промокания (одностороннее ручное промокание в других автоматических погружных аппаратах также возможно)
- Приготовьте две капли по 50 мкл и одну каплю по 100 мкл буфера для образца (например, 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,5 мМ TCEP) на чистой стороне парапленки.
- Регидратируйте сетки стрептавидина, прикоснувшись к двум каплям по 50 мкл, и дайте сетке плавать на 100 мкл капли буфера образца в течение 10 минут.
- После регидратации поднимите сетку антикапиллярным пинцетом так, чтобы изогнутый плечо антикапиллярного пинцета оказалось в капле.
- Аккуратно промокните излишки буфера сбоку и быстро нанесите 4 мкл образца 75-100 нМ.
- Инкубируют образец во влажностной камере в течение 1-5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, концентрация и время инкубации будут зависеть от образца и должны быть оптимизированы. Указанная концентрация образца и время инкубации являются рекомендуемыми отправными точками. Для образцов с низкими концентрациями можно инкубировать в течение более длительных периодов времени и/или несколько раз связывать пробу с сетками. - Приготовьте две капли замораживающего буфера по 10 мкл (например, 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,5 мМ TCEP, 3% трегалозы, 0,01% NP40) на чистой стороне парапленки. После инкубации промывают несвязанный образец, прикасаясь сеткой к первой капле замораживающего буфера. Перетащите сетку на вторую каплю замораживающего буфера.
- Быстро возьмитесь за край сетки пинцетом, прикрепленным к одностороннему автоматическому поршню. Аккуратно удалите излишки буфера и быстро нанесите 4 мкл замораживающего буфера (50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,5 мМ TCEP, 3% трегалозы, 0,01% NP40) на сетку.
- Прикрепите пинцет к одностороннему автоматическому поршню. Наилучшие результаты были получены при использовании датчика блотки, который обнаруживает каплю жидкости на сетке с интервалом от 4 до 6 с. Условия будут варьироваться в зависимости от используемой пробы и буфера.
6. Обработка данных крио-ЭМ фильмов, собранных с аффинити-решеток стрептавидина
Сбор данных на аффинных сетках стрептавидина может быть выполнен так же, как и в случае со стандартными сетками, и не требует специальной настройки под микроскопом. Однако описанная здесь процедура удаляет сигнал стрептавидина только после коррекции движения микрофотографии. Таким образом, такие этапы обработки данных, как полировка частиц, основанные на исходных кадрах фильма, не могут быть надежно выполнены. Вычитание сигнала стрептавидина (требуется для всей стандартной нисходящей обработки, кроме оценки CTF) здесь требует Matlab версии R2014b или новее, работающей в среде Linux. Вычитание сигнала основано на кристаллической природе стрептавидинового слоя, что позволяет маскировать пики и, следовательно, удалять сигнал из преобразования Фурье каждой микрофотографии.
- Настройка скриптов обработки
- Скопируйте все файлы из Supplemental Files в специальную папку в каталоге проекта
- Подготовьте каталог с именем processing_scripts, включающий следующие файлы:
lsub.m (Дополнительный файл кодирования 1; сценарий вычитания)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; сценарий-оболочка, который перебирает все доступные микрофотографии, порождает параллельные задания и отслеживает входные и выходные данные)
process_subtraction.cfg (Дополнительный файл кода 3; конфигурационный файл, содержащий параметры задания вычитания, см. 6.2) - Подготовьте каталог с именем support_scripts, который включает следующие файлы:
bg_drill_hole.m (Дополнительный файл кодирования 4)
bg_FastSubtract_standard.m (Дополнительный файл кодирования 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Дополнительный файл кодирования 6)
bg_push_by_rot.m (Дополнительный файл кодирования 7)
ReadMRC.m (дополнительный файл кодирования 8)
WriteMRC.m (дополнительный файл кодирования 9)
WriteMRCHeader.m (дополнительный файл кода 10)
- При необходимости откорректируйте конфигурационный файл (process_subtraction.cfg (см. рис. 3):
- Входные данные: Путь к каталогу, содержащему микрофотографии с коррекцией движения в формате mrc. Используйте либо каталог, либо шаблон, включающий подстановочные знаки (?, *).
Пример:
input="/путь/к/project_directory/микрофотографии/"
или
input="/путь/к/project_directory/micrographs/*.mrc" - output_dir: Путь к каталогу, в который должна быть записана решетка вычитаемых микрофотографий.
- only_do_unfinished: Укажите (true|false), следует ли перезаписывать или пропускать ранее существовавшие вычитаемые микрофотографии. Этот параметр полезен для запуска скрипта вычитания решетки в середине сеанса работы с микроскопом (по умолчанию: true).
- num_parallel_jobs. Укажите количество параллельных заданий. Это число зависит от технических характеристик оборудования, используемого для обработки, и не должно превышать количество доступных ядер. В системах с 32 ядрами и сетевой файловой системой оптимальная производительность была достигнута при выполнении 14 параллельных заданий. Для достижения наилучших результатов оптимизируйте это значение с помощью подмножества микрофотографий.
- Pad_Origin_X: 200 для детектора К3 в портретной ориентации (ширина < высота изображения) или при использовании квадратного детектора (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 для детектора К3 в альбомной ориентации (ширина изображения > высота изображения). БПФ выполняется в квадратных коробках, и заполнение требуется, если детектор имеет неквадратные размеры.
- Pad_Origin_Y: 1000 для детектора K3 в портретной ориентации (ширина < высота изображения), 200 при использовании квадратного детектора (Falcon III, Falcon IV, K2) или при использовании детектора K3 в альбомной ориентации (ширина изображения > высота изображения).
- Не меняйте Inside_Radius_Ang (90) и Outside_Radius_Ang (3.0). Вычитание решетки выполняется между двумя разрешениями (единица измерения в ангстремах).
- Pixel_Ang: укажите размер пикселя в виде значения с плавающей запятой.
- Порог: пороговое значение порога вычитания для замены решетки фоном в пространстве Фурье. Успешно используемые значения находятся в диапазоне от 1,4 до 1,6. Используйте 1.42 в качестве отправной точки.
- Не меняйте expand_pixel (10) и pad_out_opt (0). expand_pixel — это значение диаметра, используемое для маскирования вокруг пикселей со значениями, превышающими пороговое значение. pad_out_opt — это параметр, который определяет, будет ли заполненная область включена в выходные данные.
- addpath_m: Путь к скриптам поддержки.
- path_to_matlab_bin: Путь к системному каталогу bin'а установки Matlab.
- path_matlab_script: Путь к скрипту вычитания matlab (lsub.m ), который был скопирован выше в шаге 6.1.2.
- Входные данные: Путь к каталогу, содержащему микрофотографии с коррекцией движения в формате mrc. Используйте либо каталог, либо шаблон, включающий подстановочные знаки (?, *).
- После сохранения измененного скрипта запустите скрипт (bash ./process_subtraction.sh ) для вычитания сигнала стрептавидина из входных микрофотографий. Сценарий может быть прерван и/или перезапущен, если параметр only_do_unfinished установлен в true (см. шаг 6.2.3). Если возникает ошибка, просмотрите параметры, указанные в сценарии bash. Убедитесь, что между переменными параметров и присвоенными им значениями нет непреднамеренных пробелов, так как это распространенный источник ошибок.
- Используйте решетчатые вычитаемые изображения для стандартной обработки крио-ЭМ изображений.
Representative Results
После испарения углерода на стадии 3.21 (обычно через одну неделю) аффинные решетки стрептавидина можно использовать для крио-ЭМ или подготовки образцов с отрицательным окрашиванием, следуя процедурам, описанным в шагах 4 и 5. На рисунке 4А показана репрезентативная микрофотография, полученная с помощью детектора K3 на титане Krios при 81 000-кратном увеличении с размером пикселя 1,05 Å биотинилированного образца, замороженного с помощью аффинных сеток стрептавидина. Об успешном формировании решетки свидетельствует непрерывный сетчатый рисунок, который появляется на заднем плане изображения. Это легче заметить по дифракционной картине, которая появляется в быстром преобразовании Фурье (БПФ), показанном на рисунке 4A (справа). После сбора данных, следуя процедуре, описанной в шаге 6 этого протокола, сигнал, который вносится в изображение решеткой стрептавидина, может быть замаскирован с помощью вычислений для получения вычитаемой микрофотографии (рис. 4B), которая может быть использована для последующих этапов обработки данных. БПФ на рисунке 4B (справа) показывает, что дифракционная картина, наблюдаемая на рисунке 4A (справа), была успешно удалена с исходного изображения.
На рисунке 4C показан пример микрофотографии, сделанной на микроскопе Tecnai 12 при увеличении 49 000x с размером пикселя 1,6 Å биотинилированного образца, связанного с аффинными сетками стрептавидина и окрашенного отрицательно с использованием уранилформиата. Сетки были подготовлены в соответствии с процедурой, описанной в шаге 4 этого протокола, оставляя более толстую пленку красителя.
Существует несколько распространенных наблюдений, когда процедура изготовления сетки из стрептавидина оказывается неудачной, которые описаны далее в разделе обсуждения и в таблице 1. Рисунок 5 Приведено несколько примеров таких наблюдений. На рисунке 5А показана микрофотография отрицательно окрашенной аффинной сетки стрептавидина, использованной из партии, изготовленной более шести месяцев назад. Монослой мобилизовался из отверстий в углеродной фольге сеток квантифойла и наблюдается с размерами, аналогичными отверстиям в сетке. На рисунке 5B показан пример кристаллов стрептавидина с высокой мозаичностью, которые легко возмущаются во время процедур пробоподготовки. На рисунке 5С показана репрезентативная микрофотография с аффинной сетки стрептавидина, в которой испарение углерода на этапе 3.21 слишком тонкое или опущено. Решетка стрептавидина фрагментировалась в процессе крио-ЭМ пробоподготовки. На рисунке 5D показана отрицательно окрашенная аффинная сетка стрептавидина, которая имеет загрязнение липидными везикулами, вероятно, из-за недостаточной промывки во время стадии 3.13 или намокания золотой стороны сетки во время шагов 3.13-3.20. Пожалуйста, обратитесь к разделу «Обсуждение» и таблице 1 для получения информации о стратегиях преодоления этих распространенных проблем.
Рисунок 1: Схема процедуры изготовления аффинной сетки стрептавидина. (A) Обзорная хронология процедуры изготовления аффинной сетки стрептавидина. Вся процедура может быть завершена в течение двух недель, требуя двух этапов испарения углерода и одной недели после каждого, чтобы позволить углероду достаточно созреть. (B) Увеличенный вид квадрата сетки сродства стрептавидина, показывающего слои, составляющие сетку после завершения процесса изготовления, включая стандартную крио-ЭМ сетку с золотыми слитками и дырчатой углеродной пленкой, первый испаряющийся углеродный слой, липидный монослой, кристалл 2D-стрептавидина и задний вспаренный углеродный поддерживающий слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Монослой липидов и кристаллизация стрептавидина (A) Изображения, демонстрирующие, как успешно сформировать липидный монослой в маленькой чашке Петри с использованием талька для создания границы для касторового масла, которое создает постоянное поверхностное давление при формировании липидного монослоя. (B) Изображения, демонстрирующие, как выращивать кристаллы стрептавидина на крио-ЭМ решетках. Сначала углеродная сторона сеток прикасается к липидному монослою, а затем следует три последовательные промывки в кристаллизационном буфере. Добавляют стрептавидин, а сетки инкубируют во влажностной камере в течение 2 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры параметров файла process_subtraction.cfg для выполнения вычитания решетки стрептавидина из микрофотографий (шаг 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты успешного изготовления аффинной сетки стрептавидина. (A) Крио-ЭМ микрофотография биотинилированных белково-нуклеосомных комплексов, приготовленных с помощью самодельных аффинных сеток стрептавидина. БПФ показан справа и показывает дифракционную картину кристалла стрептавидина. (B) Та же микрофотография, что и на панели А, показана после процедуры вычитания решетки для удаления сигнала от 2D-кристалла стрептавидина из исходного изображения. (C) Пример микрофотографии, полученной в результате негативного окрашивания биотинилированного образца, связанного со стрептавидин-аффинными сетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты неудачного изготовления аффинной сетки стрептавидина. (A) Микрофотография, показывающая мобилизацию монослоя стрептавидина из отверстий сетки, когда сетки старше шести месяцев. (B) Микрофотография, показывающая решетки стрептавидина с высокой мозаичностью, которые легко повреждаются как при крио-ЭМ, так и при процедурах подготовки образцов с отрицательным окрашиванием. (C) Микрофотография, показывающая фрагментацию решетки стрептавидина во время подготовки крио-ЭМ образца, когда слой испарения углерода на стадии 3.21 слишком тонкий или опущен. (D) Репрезентативная микрофотография, загрязненная липидными везикулами, вероятно, из-за недостаточной промывки во время шага 3.13 или намокания золотой стороны сетки во время шагов 3.13-3.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Руководство по устранению неполадок для преодоления часто возникающих проблем, возникающих при неудачном изготовлении аффинити-сетки стрептавидина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Дополнительный файл кода 1: lsub.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 2: process_subtration.sh Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 3: process_subtraction.cfg Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 4: bg_drill_hole.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 5: bg_FastSubtract_standard.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 7: bg_push_by_rot.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кода 8: ReadMRC.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 9: WriteMRC.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кода 10: WriteMRCHeader.m Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Наш протокол описывает, как создавать и использовать аффинные сетки стрептавидина и как обрабатывать данные, содержащие дифракционный сигнал стрептавидина. В протоколе есть несколько важных шагов, которые требуют особого внимания.
Неудачные пакеты сетки могут быть связаны с несколькими распространенными ошибками. Наиболее распространенным источником ошибок является использование устаревших или некачественных реагентов. Особенно важно приготовить раствор биотинилированных липидов в точности так, как описано в протоколе. Кроме того, любые примеси, такие как остатки моющего средства на лабораторной посуде или натуральные масла на коже, могут повлиять на качество кристаллов стрептавидина и, следовательно, на качество получаемых изображений. Поэтому рекомендуется выполнить три цикла промывки решеток перед первым испарением углерода, чтобы удалить возможное загрязнение поверхностно-активными веществами от производителя сети (шаг 2.1). Кроме того, было замечено, что загрязнение или примесь касторового масла препятствуют образованию кристаллов на сетке.
Создание и захват липидного монослоя – это задача, которую следует попрактиковать несколько раз, чтобы почувствовать небольшие объемы липидов. Нет ничего необычного в том, что этот этап терпит неудачу в первые два-три раза, прежде чем может быть получен адекватный липидный монослой, что в конечном итоге отражается на качестве кристаллов стрептавидина, которые видны в отрицательно окрашенных сетках (рис.
Важно ни в коем случае не допускать намокания тыльной стороны сетки (золотой стороны, липидной стороны) в процессе изготовления сетки (шаги 3.12-3.20). В случае, если тыльная сторона все-таки намокнет, рекомендуется отказаться от сетки. Это может привести к появлению крупных липидных везикул, которые нарушают качество изображения (рис. 5D) (строка 3, таблица 1). Липидные везикулы также могут наблюдаться из-за недостаточной промывки после нанесения липидного монослоя (шаг 3.13). Рекомендуется провести три последующие промывки с использованием кристаллизационного буфера после прикосновения к липидному монослою перед добавлением стрептавидина.
После того, как тонкий слой углерода был испарен на решетках, внедренных трегалозой, тыльная сторона решетки может быть влажной, не повреждая качество решетки. Например, часто наблюдается намокание тыльной стороны, когда буфер образца содержит даже минимальное количество моющего средства. Смачивание обратной стороны образцом может привести к неспецифическому связыванию образцов с тонкой углеродной пленкой на обратной стороне, что снижает эффективность предотвращения диффузии частиц на границу раздела воздух-вода или использования аффинного связывания для стратегий очистки в сетке. Если есть возможность, добавьте пробу в сетку при отсутствии моющего средства. Моющее средство и другие добавки могут быть добавлены впоследствии на этапах промывки сетки или добавлены на заключительном этапе перед стекловидованием. Это одно из ограничений для использования аффинных решеток стрептавидина; Однако, если цель состоит в том, чтобы улучшить преимущественную ориентацию, подготовка проб с использованием буферов, включая моющее средство, была успешно проведена11.
Общий источник ошибок может быть прослежен до возраста решеток относительно обеих стадий испарения углерода (шаг 2.3 и шаг 3.21). В этом протоколе рекомендуемый период ожидания составляет 5-7 дней после испарения углерода с обратной стороны перед использованием стрептавидиновых сеток для крио-ЭМ. Когда сетки используются слишком рано после изготовления, было замечено, что решетка и липидный монослой мобилизуются из отверстий сетки. Аналогичное наблюдение может быть сделано, когда сетки слишком стары и используются через шесть месяцев (рис. 5А) (строка 1, таблица 1). Мы предполагаем, что это наблюдение объясняется изменениями гидрофобности углеродной основы, применяемой для стабилизации липидного монослоя и кристаллов стрептавидина. Кроме того, решетки стрептавидина могут выглядеть мозаичными (рис. 5Б) (ряд 3, таблица 1) и нарушаться как в отрицательном окрашивании, так и в крио-ЭМ, если монослой наносится на решетки, где первый слой испарения углерода (шаг 2.3) недостаточно состарился.
Еще одним распространенным источником ошибок может быть хрупкость кристаллического монослоя стрептавидина (липидный монослой сам по себе является жидким и может обратимо расширяться или сжиматься). Обратное испарение углерода (этап 3.21) обеспечивает критическую стабильность как монослоя, так и решетки стрептавидина во время процесса адсорбции образца, промывки и крио-ЭМ-блоттинга. При отсутствии достаточного испарения углерода на обратной стороне сетки решетки стрептавидина часто будут выглядеть фрагментированными после промокания/замораживания (Рисунок 5C) (Строка 2, Таблица 1). В этом протоколе мы предлагаем использовать одностороннюю автоматизированную погружную морозильную камеру для одностороннего промокания. Этот метод позволяет получить высоковоспроизводимые условия блоттинга, которые сохраняют решетку стрептавидина в процессе замораживания и позволяют оптимизировать применение образца и параметры блоттинга. В качестве альтернативы используются другие автоматические аппараты для погружной заморозки в сочетании с ручным промоканием. Для этого в настройках устройства отключается собственно функция промокательной бумаги, а вместо нее промокается сетка, протягивая пинцетом промокательную бумагу через боковой вход. Этот метод позволяет достичь высококачественных результатов для лабораторий без одностороннего промокательного и погружного морозильного устройства; Тем не менее, воспроизводимость между сетками является сложной задачей.
Несмотря на то, что использование аффинити-сеток стрептавидина имеет много преимуществ, необходимо учитывать некоторые ограничения этого метода. Из-за характера процедуры обычно невозможно оценить качество решетки стрептавидина до тех пор, пока не будет завершен весь процесс. Перед замораживанием образцов рекомендуется быстро проверять качество каждой партии негативным окрашиванием. Из-за сигнала, вносимого решеткой стрептавидина в необработанные изображения, в некоторых случаях может быть сложно оценить, достаточно ли неповрежденных, дисперсных частиц на основе одних только изображений. По этой же причине обработка крио-ЭМ данных «на лету» во время сбора данных невозможна, если в конвейер предварительной обработки данных не включена процедура вычитания сигнала стрептавидина. Поскольку сигнал стрептавидина обычно вычитается из изображений с коррекцией движения, а не из самих кадров, байесовская полировка, реализованная в популярных программных пакетах, может завершиться ошибкой при использовании описанных процедур вычитания. Поэтому рекомендуется выполнять коррекцию движения в нескольких участках, чтобы свести к минимуму движение частиц с самого начала обработки данных16.
Несмотря на эти ограничения, аффинные сетки стрептавидина обладают многими преимуществами. Два основных преимущества, которые обеспечивают сродственные сетки стрептавидина по сравнению со стандартными крио-ЭМ сетками с открытым отверстием, заключаются в том, что они защищают образцы от границы раздела воздух-вода и концентрируют образцы с низким содержанием (10-100 нМ) на сетке. Другие вспомогательные слои, такие как оксид углерода и графена, также могут использоваться в качестве стратегий для преодоления этих узких мест при подготовке проб. В одном из примеров аффинные решетки стрептавидина были единственным решением для получения неповрежденной реконструкции взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой, которая была несовместима с подходами сшивания. 12 См.
Еще одним важным преимуществом, которое обеспечивают аффинные решетки стрептавидина, является решение для образцов, которые адсорбируются на других поддерживающих слоях, таких как оксид углерода или графена, с предпочтительной ориентацией, которая препятствует возможности получения 3D-реконструкции интересующего образца. Случайное биотинилирование образцов с использованием коммерчески доступных наборов позволяет случайным образом прикрепить интересующий образец к монослою стрептавидина для получения большего количества потенциальных представлений для решения этой проблемы.
Кроме того, аффинити-сетки стрептавидина обладают преимуществами, уникальными для аффинити-сеток. Высокое сродство и специфичность взаимодействия стрептавидидина с биотином позволяют связывать аффинные решетки стрептавидина с другими рабочими процессами, в которых используется биотин для очистки интересующих комплексов. В одном опубликованном примере авторы иммобилизовали комплекс на аффинных решетках стрептавидина и инкубировали связывающего партнера с неизвестной стехиометрией в большом избытке. После смывания любого несвязанного белка был получен правильно собранный суперкомплекс, который можно было сразу же проанализировать с помощью крио-ЭМ11. Одним из возможных будущих применений может быть комбинирование стрептавидин-связывающих белковых меток, системы Avi-tag или подходов к близкому мечению с аффинными сетками стрептавидина для извлечения отдельных белков и/или белковых комплексов непосредственно из рекомбинантных или эндогенных источников без стандартных сложных схем очистки.
Предоставив этот протокол, лаборатории смогут легко воспроизвести изготовление аффинных сеток стрептавидина и сделать их более часто используемым инструментом для структурного анализа белковых комплексов с помощью крио-ЭМ.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
T.C. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук на обучение молекулярной биофизике GM-08295 и стипендией Национального научного фонда в рамках гранта DGE 2146752. Р.Г. и Б.Х. были поддержаны грантом Национального института здравоохранения R21-GM135666, присужденным Р.Г. и Б.Х. Эта работа была частично профинансирована за счет гранта R35-GM127018 Национального института общих медицинских наук, присужденного Е.Н. Е.Н. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
