Summary
En trinnvis protokoll for fremstilling av streptavidin-affinitetsnett er gitt for bruk i strukturelle studier av utfordrende makromolekylære prøver ved kryo-elektronmikroskopi.
Abstract
Streptavidin-affinitetsrutenett gir strategier for å overvinne mange vanlige kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) prøveprepareringsutfordringer, inkludert prøvedenaturering og preferanseorienteringer som kan oppstå på grunn av luft-vanngrensesnittet. Streptavidin-affinitetsnett brukes imidlertid for tiden av få kryo-EM-laboratorier fordi de ikke er kommersielt tilgjengelige og krever en forsiktig fabrikasjonsprosess. Todimensjonale streptavidinkrystaller dyrkes på et biotinylert lipidmonolag som påføres direkte på standard holey-karbon kryo-EM-gitter. Interaksjonen med høy affinitet mellom streptavidin og biotin muliggjør påfølgende binding av biotinylerte prøver som er beskyttet mot luft-vann-grensesnittet under preparering av kryo-EM-prøver. I tillegg gir disse rutene en strategi for å konsentrere prøver tilgjengelig i begrensede mengder og rense proteinkomplekser av interesse direkte på rutenettene. Her er det gitt en trinnvis, optimalisert protokoll for robust fabrikasjon av streptavidin-affinitetsgitter for bruk i kryo-EM og eksperimenter med negativ flekk. I tillegg er en feilsøkingsveiledning inkludert for vanlige utfordringer for å gjøre bruken av streptavidin-affinitetsnett mer tilgjengelig for det større kryo-EM-samfunnet.
Introduction
Elektronkryomikroskopi (kryo-EM) har revolusjonert feltet strukturbiologi ved å muliggjøre makromolekylær strukturbestemmelse av store, fleksible og heterogene prøver som tidligere var utilgjengelige ved røntgenkrystallografi eller kjernemagnetisk resonans1. Denne metoden fungerer ved å flash-fryse makromolekyler i løsning for å skape et tynt lag av glassaktig is som senere kan avbildes ved hjelp av et elektronmikroskop. I de senere år har betydelige fremskritt innen både mikroskopmaskinvare og bildebehandlingsprogramvare ytterligere utvidet prøvetypene som er egnet for høyoppløselig strukturbestemmelse av cryo-EM.
Likevel er fremstillingen av tynne, forglassede prøver fortsatt et av de mest kritiske trinnene i makromolekylær strukturbestemmelse ved kryo-EM. Biologiske prøver er ofte dynamiske, skjøre, utsatt for denaturering, og noen ganger er de bare tilgjengelige i små mengder for kryo-EM-studier. Under blottingsprosessen interagerer disse partiklene med det hydrofobe luft-vanngrensesnittet, noe som kan resultere i partikkelforetrukne retninger, demontering av skjøre komplekser, delvis eller fullstendig prøvedenaturering og aggregering 2,3,4. Bruk av vaskemidler eller andre overflateaktive stoffer, kjemisk kryssbinding og adsorpsjon av prøver for å støtte lag er vanlige strategier for å bevare biologiske prøver under fryseprosessen. Støttelag som grafenoksid 5,6,7 eller amorft karbon8 fungerer også for å konsentrere partikler på rutenettet ved adsorpsjon når prøven er tilgjengelig i begrensede mengder. Disse metodene er imidlertid ikke generelle eller pålitelige, og optimalisering av klargjøring av nettet kan være ekstremt tidkrevende eller mislykkes helt.
Streptavidin affinitetsnett 9,10 ble utviklet for å overvinne disse manglene og for å gi en mild og generelt anvendelig metode for å binde komplekset av interesse og beskytte det mot luft-vann-grensesnittet. Disse rutene benytter et todimensjonalt (2D) streptavidinkrystallgitter dyrket på et monolag av biotinylerte lipider på rutenettet. Etter at prøvene selv er biotinylert (ofte sparsomt og tilfeldig, noe som betyr ett biotin per kompleks i gjennomsnitt), kan de påføres det streptapavidinbelagte rutenettet. Fordi prøveadsorpsjon er avhengig av den ekstremt høye affiniteten mellom streptavidin og biotin, kan prøvekonsentrasjoner så lave som 10 nM brukes med disse rutene. Kommersielt tilgjengelige biotinyleringssett for proteiner og biotinylerte primere for DNA-holdige komplekser gjør det relativt enkelt å feste de nødvendige biotindelene til de fleste prøver av interesse. I tillegg til å konsentrere prøven og holde den borte fra det skadelige luft-vanngrensesnittet under blotting, kan tilfeldig biotinylering av en eller bare noen få lysinrester forbedre orienteringsområdet til molekylet av interesse på kryo-EM-rutenettet, som demonstrert i en rekke studier11. Mens signalet fra den underliggende streptavidinkrystallen er tilstede i råbildene, kan databehandlingsskjemaer som involverer Fourierfiltrering av de skarpe Bragg-refleksjonene fra krystallen enkelt fjernes under tidlig databehandling, noe som til slutt muliggjør høyoppløselige rekonstruksjoner av prøven av interesse 11,12,13. Her er det gitt en optimalisert, trinnvis protokoll for robust produksjon av streptavidin-affinitetsnett og påfølgende bruk i kryo-EM-eksperimenter. Den oppgitte protokollen forventes ferdigstilt i løpet av en 2-ukers periode (figur 1A). De første delene av protokollen beskriver fremstilling av reagenser, forbehandling av rister og de første karbonfordampningstrinnene. Deretter beskrives instruksjoner for fremstilling av lipidmonolaget og veksten av streptapavidinkrystaller på EM-rister. I tillegg er det gitt instruksjoner for bruk av streptavidin-affinitetsgitter i EM- og kryo-EM-eksperimenter med negativ flekk. Til slutt er det gitt prosedyrer for fjerning av streptapavidin-signal fra mikrografer når kryo-EM-data er innhentet.
Protocol
1. Fremstilling av reagenser
- Fortynn kommersielt innkjøpt streptavidin til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml i krystallisasjonsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10 % trehalose). Pass på at den endelige trehalosekonsentrasjonen er 10%. Flash-fryse alikoter på 25-50 μL i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C.
- Løs opp 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(biotinyl) natriumsalt i 65:35:8 v/v/v kloroform/metanol/vann-løsningsmiddel for en endelig lipidkonsentrasjon på 1 mg/ml. Oppbevar engangsalikoter på 20-30 μL ved -80 °C i hetteglass.
MERK: Tilberedning av løsningsmiddel er mer nøyaktig hvis det gjøres etter vekt. Kombiner først 1,85 g ultrarent vann med 6,41 g høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) metanol og tilsett dette til 22,42 g kloroform for å forberede løsningsmidlet.
FORSIKTIG: Les og forstå produsentens sikkerhetsdatablad og anbefalte instruksjoner for håndtering og avhending av organiske kloroforme og metanolorganiske løsningsmidler før du begynner denne protokollen. Unngå direkte kontakt av metanol med huden.
2. Forbehandling av rister
- Vask karbonfolie på gullnettgitter ved å dyppe to ganger i 100% kloroform og en gang i 100% etanol. Plasser rister på rent filterpapir for å tørke. Gjenta vaskeprosessen i totalt tre sykluser.
MERK: Reproduserbar suksess er oppnådd med kommersielt tilgjengelige karbonfoliegitter som har en karbonfilm på 10-12 nm tykt karbon (se materialliste) med hullstørrelser fra 0,6-2 μm. Kommersielt tilgjengelige gullfoliegitter og hjemmelagde holey-karbongitter utarbeidet etter Rubinstein-laboratoriets nanofabrikasjonsprotokoll14 har også blitt brukt. Mindre reproduserbare resultater er oppnådd med kommersielt tilgjengelige nett som har tynnere karbonfilmer. Ikke bruk kobbergitter, da kobber reagerer med organiske aminer som kan være i prøven. - Etter at ristene tørker, fordamp et 2,5-5 nm tykt lag karbon på karbonsiden av holey-karbongitterene. Karbontykkelse kontrolleres med måling av kvartskrystallfilmtykkelse som er innebygd i karbonfordamperen som er gitt i materialfortegnelsen .
- La det nylig fordampede karbonet eldes (dvs. bli mer hydrofobt) i 1 uke.
3. Fremstilling av streptavidin gitter
MERK: For å dyrke 2D streptavidinkrystaller på holey-karbon EM-rutenettene, påføres først et biotinylert lipidmonolag på hullene i karbonfilmen (figur 1B) ved Langmuir-Schaefer-overføring. Lipidmonolaget dannes etter de påfølgende trinnene (figur 2). Talkumpulver skaper en grense mellom ricinusolje og petriskålen, og et tynt lag ricinusolje bidrar til å opprettholde konstant overflatetrykk når lipidmonolaget dannes. Siden som inneholder fordampet karbon fra trinn 2.2 brukes til å plukke opp monolaget, overskytende lipider vaskes bort med krystallisasjonsbuffer, og streptapavidinoppløsning inkuberes på rutenettet for krystallisering.
- Rengjør benkområdet med 70% etanol.
- Skyll en 5 μL glasssprøyte flere ganger med kloroform for å rengjøre. La sprøyten tørke helt før bruk.
- Vask karbonfordampede rister igjen, dvs. like før bruk, ved å dyppe dem i 100% etanol. La ristene tørke på rent filterpapir.
- Mens ristene tørker, vask hver antikapillærpinsett med 100% kloroform og 100% etanol. La pinsetten tørke helt.
- På den rene siden av parafilm, lag tre 50 μL dråper krystallisasjonsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) for hvert rutenett som skal gjøres.
- Fyll lokket på en 35 mm ubestrøket petriskål med krystalliseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). Rengjør overflaten med linsepapir.
- Dryss talkumpulver av vitenskapelig kvalitet rundt omkretsen av petriskålen. Dette fungerer deretter som en indikator, i neste trinn, på hvor langt ricinusoljen har spredt seg. Tilsett nok talkumpulver til å skape en barriere som beskytter ricinusoljen mot å berøre kanten av petriskålen. Tilsetning av for mye talkumpulver begrenser den tilgjengelige plassen for å lage lipidmonolaget.
- Dypp en 200 μL pipettespiss i ricinusoljen for å oppnå en middels stor dråpe (ca. 20 μL) som henger fra pipettespissen. Berør denne dråpen til overflaten av bufferen i petriskålen, hvor den vil spre seg for å danne en jevn film. Den resulterende tynne filmen av olje tjener som et stempel15, som opprettholder et konstant overflatetrykk når et lipidmonolag dannes (trinn 3.10).
MERK: Det er viktig å tilsette nok lakserolje i stedet for for lite, og det er bedre å legge til som en enkelt dråpe. La ricinusoljen spre seg helt før du lager lipidmonolaget. - Skyll 5 μL glasssprøyten en eller to ganger med det oppløste lipidet før du tar opp en alikot til bruk. Unngå å lage luftbobler i lipidet som fyller sprøyten.
MERK: Glasssprøyten skylles med oppløst lipid i tilfelle det gjenstår gjenværende kloroform fra trinn 3.2. Resterende kloroform kan påvirke kvaliteten på det resulterende monolaget. - Dispenser det minste mulige volumet (~0,5 μL) lipid fra sprøyten og berør forsiktig den hengende dråpen til overflaten av ricinusoljefilmen. Legg merke til at lipidoppløsningen bryter gjennom ricinusoljefilmen ved kontaktpunktet, og at det resulterende lipidmonolaget danner en sirkel i midten av den tynne filmen av ricinusolje.
- Tilsett flere dråper lipid sekvensielt eller tilsett mer lipid etter å ha laget noen rister, men hvis for mye tilsettes, vil lipidet spre seg forbi grensen til ricinusoljen og inn i omkretsen der talkumpulveret og eventuelt forurensende overflateaktivt middel har blitt sekvestrert. Hvis dette skjer, må prosessen startes på nytt.
- Plukk opp et rutenett med en antikapillær pinsett slik at den rette armen på pinsetten og den karbonfordampede siden av rutenettet begge vender mot monolaget.
- Overfør en del av monolaget til holeykarbonet ved å berøre den karbonfordampede siden av rutenettet til monolaget i 1-2 s.
MERK: Vellykket overføring indikeres av at overflaten av rutenettet blir hydrofil, noe som forårsaker en tynn, sfærisk bufferhette for å dekke hele rutenettet etter at det har blitt løftet bort fra petriskålen. - Berør den sfæriske hetten på bufferen som nå fester seg til rutenettet, sekvensielt i 1 s hver, til de tre 50 μL-dråpene krystallisasjonsbuffer som ble fremstilt på parafilm i trinn 3.5.
MERK: Dette trinnet forsøker å fjerne så mye som mulig av overflødig lipid, som dekker overflaten av den sfæriske hetten (i stedet for den tidligere hydrofobe karbonfilmen), for å unngå dannelse av lipidvesikler når prøver ses i elektronmikroskopet. - Tilsett forsiktig 4 μL 0,5 mg/ml streptavidin i den gjenværende sfæriske lokket av krystallisasjonsbuffer på risten.
- Plasser rutenettet i et fuktighetskammer. Gjenta trinn 3.11–3.14 for hele bunken med rutenett.
- Inkuber ristene ved romtemperatur (RT) i 2 timer inne i et fuktighetskammer for å unngå fordampning.
MERK: Det er viktig at gullsiden av rutenettet ikke blir våt på noe tidspunkt etter at monolaget er påført. - Etter 2 timers inkubasjon, lag en 300 μL dråpe skyllebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) for hvert rutenett på den rene siden av parafilm.
MERK: Skyllebufferen inneholder 50 mM KCl i stedet for 150 mM KCl, som er i krystallisasjonsbufferen som brukes for trinn 3,5-3,6. - Vask overflødig (ubundet) streptavidin ved å plassere risten på 300 μL dråpe skyllebuffer. Utfør trinn 3.18–3.20 for ett rutenett om gangen. Unngå å la ristene stå på 300 μL skyllebufferfall i lengre perioder.
MERK: Bare en vask utføres fordi streptavidinkrystall / monolaget er skjørt på dette tidspunktet. Hver gang et rist løftes vekk fra overflaten av en dråpe vaskebuffer, sprekker væskebroen mellom risten og vaskedråpen. På bruddtidspunktet påføres en forbigående trykkgradient (sugetrykk) på de selvbærende monolagskrystallene som spenner over de åpne hullene i karbonfilmen. Dette sugetrykket forventes å forårsake forbigående doming av monolagskrystallen, ledsaget av utvidelse av området dekket av krystallene. Hvis økningen i området overskrider krystallens elastiske grense, kan krystallet sprekke eller bli uordnet. - Tørk umiddelbart antikapillærpinsetten med en lofri klut for å lette frigjøringen av rutenettet på filterpapir i neste trinn. Plukk opp rutenettet som flyter på dråpen skyllebuffer ved å stikke den knekkede armen til antikapillærpinsetten inn i dråpen.
- Fjern overflødig buffer forsiktig fra siden med filterpapir. Plasser risten på filterpapir med gullsiden ned, gjenta trinn 3,18-3,20 for hvert rutenett, og la ristene tørke i 15-20 min.
- Etter at ristene er tørre, snu dem slik at gullsiden nå vender opp. Fordamp et tynt lag karbon (ca. 0,5-2 nm tykt) på gullsiden av ristene.
MERK: Oppbevar rister med konstant fuktighet, hvis verdi ikke ser ut til å ha betydning, og merk at flere endringer i relativ fuktighet forventes å resultere i sykluser av ekspansjon og sammentrekning. La ristene eldes i 1 uke før bruk av kryo-EM for best resultat, fordi hydrofobisiteten på baksiden av rutenettet kan være viktig for monolagstabilitet. Rister er stabile i lange perioder, men etter 3 måneder kan baksidekarbonet bli mindre hydrofobt.
4. Kontrollere streptavidin affinity grid batch kvalitet ved negativ flekk
- Forbered to dråper på 50 μL og en dråpe 100 μL prøvebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) på den rene siden av parafilm.
- Fjern trehalose- og rehydrer streptavidin-ristene ved å berøre de to 50 μL-dråpene og la risten flyte på 100 μL-dråpen prøvebuffer i 10 minutter.
MERK: Det er best å unngå å bruke vaskemiddel under rehydrering og påfølgende prøvebindende inkubasjoner. Bufferen vil spre seg til gullsiden av ristene og begrense effektiviteten av vasker for å fjerne overflødige prøver. - Etter rehydrering, plukk rutenettet opp med en antikapillær pinsett slik at den knekkede armen til antikapillærpinsetten er i dråpen.
- Fjern forsiktig overflødig buffer bort fra siden og påfør raskt 4 μL med 75-100 nM prøve (valgfritt).
NOTAT: Unngå å la rutenettet tørke etter rehydrering. - Inkuber prøven i et fuktighetskammer i 1-5 minutter.
MERK: Konsentrasjon og inkubasjonstider vil være prøveavhengige og bør optimaliseres. Den oppgitte prøvekonsentrasjonen og inkubasjonstiden er foreslåtte utgangspunkter. - På den rene siden av parafilm, sett opp fire dråper 30 μL hver av både prøvebuffer og 1% uranyl formate (UF) flekk.
MERK: Les og forstå produsentens sikkerhetsdatablad og anbefalte instruksjoner for håndtering og destruksjon av uranyl formate før du utfører dette trinnet. Uranyl formate er en giftig og radioaktiv forbindelse. Sørg for å innhente institusjonsgodkjenning på forhånd for bruk av radioaktivt materiale. - Vask bort den ubundne prøven ved å berøre hver av de fire dråpene med prøvebuffer.
- Beis prøven ved hjelp av standard negative flekkprosedyrer med UF. Fjern forsiktig UF-flekken fra siden, og etterlat et veldig tykt lag med flekk på rutenettet. Ytterligere 0,5 μL flekk kan påføres risten etter blotting for å gjøre flekken tykkere om nødvendig. La risten lufttørke.
MERK: Siden streptavidin-ristene er veldig hydrofile, har negativ flekk en tendens til å danne en veldig jevn film overalt, i motsetning til det som ofte ses ved bruk av glødeutladningsbehandlede, kontinuerlige karbongitter. Som et resultat anbefales det å legge en tykkere film av flekkløsning.
5. Frysing av streptavidin-affinitetsgitter med biotinylerte prøver
MERK: Følgende prosedyre er beregnet på et ensidig automatisert stempel som inneholder en intern blottingssensor (ensidig manuell blotting i andre automatiserte stupapparater er også mulig)
- Forbered to dråper på 50 μL og en dråpe 100 μL prøvebuffer (f.eks. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) på den rene siden av parafilm.
- Rehydrer streptavidin-ristene ved å berøre de to 50 μL-dråpene og la risten flyte på 100 μL-dråpen prøvebuffer i 10 minutter.
- Etter rehydrering, plukk rutenettet opp med en antikapillær pinsett slik at den knekkede armen til antikapillærpinsetten er i dråpen.
- Fjern forsiktig overflødig buffer bort fra siden og påfør raskt 4 μL med 75-100 nM prøve.
- Inkuber prøven i et fuktighetskammer i 1- 5 min.
MERK: Igjen vil konsentrasjon og inkubasjonstider være prøveavhengig og bør optimaliseres. Den oppgitte prøvekonsentrasjonen og inkubasjonstiden er foreslåtte utgangspunkter. For prøver i lave konsentrasjoner kan man ruge over lengre tidsperioder og/eller binde prøven til ristene flere ganger. - Forbered to 10 μL dråper frysebuffer (f.eks. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalose, 0,01% NP40) på den rene siden av parafilm. Etter inkubering, vask den ubundne prøven ved å berøre rutenettet til den første dråpen av frysebufferen. Slipp rutenettet på den andre dråpen av frysebufferen.
- Ta raskt tak i kanten av rutenettet med pinsetten festet til det ensidige automatiserte stempelet. Fjern overflødig buffer forsiktig og påfør raskt 4 μL frysebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3 % trehalose, 0,01 % NP40) på nettet.
- Fest pinsetten til det ensidige automatiserte stempelet. De beste resultatene er oppnådd ved hjelp av en blot-sensor som oppdager væskefallet på rutenettet med blotttider mellom 4-6 s. Betingelsene vil variere avhengig av prøven og bufferen som brukes.
6. Databehandling av kryo-EM-filmer samlet inn fra streptavidin-affinitetsnett
Datainnsamling på streptavidins affinitetsrutenett kan utføres som med standardnett, og ingen spesielle mikroskopjusteringer er nødvendige. Prosedyren som er beskrevet her, fjerner imidlertid streptavidinsignalet først etter bevegelseskorreksjon av mikrografen. Derfor kan ikke databehandlingstrinn, for eksempel partikkelpolering som er avhengige av originale filmrammer, utføres pålitelig. Streptavidin-signalsubtraksjonen (kreves for all standard nedstrømsbehandling bortsett fra CTF-estimering) her krever Matlab versjon R2014b eller nyere som kjører på et Linux-miljø. Signalsubtraksjon er avhengig av den krystallinske naturen til streptapavidinlaget, noe som muliggjør toppmaskering og dermed signalfjerning fra Fourier-transformasjonen av hver mikrograf.
- Sette opp behandlingsskriptene
- Kopier alle filer fra tilleggsfiler til en egen mappe i prosjektkatalogen
- Klargjør en katalog kalt processing_scripts som inneholder følgende filer:
lsub.m (tilleggskodingsfil 1; subtraksjonsskriptet)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; wrapper script som looper over alle tilgjengelige mikrografer, gyter parallelle jobber og holder styr på input og output)
process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; konfigurasjonsfil som inneholder parametrene for subtraksjonsjobben, se 6.2) - Klargjør en katalog kalt support_scripts som inneholder følgende filer:
bg_drill_hole.m (tilleggskodefil 4)
bg_FastSubtract_standard.m (tilleggskodefil 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (tilleggskodefil 6)
bg_push_by_rot.m (tilleggskodefil 7)
ReadMRC.m (tilleggskodingsfil 8)
WriteMRC.m (tilleggskodingsfil 9)
WriteMRCHeader.m (tilleggskodingsfil 10)
- Juster konfigurasjonsfilen etter behov (process_subtraction.cfg, (se figur 3) etter behov:
- Inngang: Banen til katalogen som inneholder bevegelseskorrigerte mikrografer i mrc-format. Bruk enten en katalog eller et mønster med jokere (?, *).
Eksempel:
input="/path/to/project_directory/micrographs/"
eller
input="/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc" - output_dir: Sti til katalogen som gitteret subtrahert mikrografer skal skrives til.
- only_do_unfinished: Spesifiser (true |false) hvis eksisterende subtraherte mikrografer skal overskrives eller hoppes over. Denne parameteren er nyttig for å starte gittersubtraksjonsskriptet midt i en mikroskopøkt (standard: sann).
- num_parallel_jobs: Angi antall parallelle jobber. Dette nummeret avhenger av maskinvarespesifikasjonene som brukes til behandling og bør ikke være høyere enn antall tilgjengelige kjerner. På systemer med 32 kjerner og et nettverksfilsystem ble optimal ytelse oppnådd med 14 parallelle jobber. Du får best ytelse ved å optimalisere denne verdien med et delsett av mikrografer.
- Pad_Origin_X: 200 for en K3-detektor i stående retning (bildebredde < bildehøyde) eller ved bruk av firkantdetektor (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 for en K3-detektor i liggende retning (bildebredde > bildehøyde). FFT utføres i firkantede bokser og polstring er nødvendig hvis detektoren har ikke-kvadratiske dimensjoner.
- Pad_Origin_Y: 1000 for en K3-detektor i stående retning (bildebredde < bildehøyde), 200 ved bruk av firkantdetektor (Falcon III, Falcon IV, K2) eller ved bruk av K3-detektor i liggende retning (bildebredde > bildehøyde).
- Ikke endre Inside_Radius_Ang (90) og Outside_Radius_Ang (3.0). Gittersubtraksjonen utføres mellom to oppløsninger (enheten er i angstrom).
- Pixel_Ang: Angi bildepunktstørrelsen som en flyttallsverdi.
- Terskel: Grenseverdi for subtraksjonsterskel for å erstatte gitteret med bakgrunnen i Fourier-rommet. Vellykket brukte verdier er mellom 1,4-1,6. Bruk 1,42 som utgangspunkt.
- Ikke endre expand_pixel (10) og pad_out_opt (0). expand_pixel er en diameterverdi som brukes til å maskere rundt bildepunkter med verdier som er høyere enn terskelgrensen. pad_out_opt er et alternativ som bestemmer om et polstret område er inkludert i utdataene.
- addpath_m: Sti til støtteskriptene.
- path_to_matlab_bin: Bane til systemets Matlab-installasjonsbokskatalog.
- path_matlab_script: Sti til matlab-substraksjonsskriptet (lsub.m) som er kopiert ovenfor under trinn 6.1.2.
- Inngang: Banen til katalogen som inneholder bevegelseskorrigerte mikrografer i mrc-format. Bruk enten en katalog eller et mønster med jokere (?, *).
- Etter å ha lagret det modifiserte skriptet, kjør skriptet (bash ./process_subtraction.sh ) for å trekke streptavidinsignalet fra inngangsmikrografene. Skriptet kan avbrytes og/eller startes på nytt hvis parameteren only_do_unfinished er satt til sann (se i trinn 6.2.3). Hvis det oppstår en feil, ser du gjennom parameterne som er angitt i bash-skriptet. Forsikre deg om at det ikke er utilsiktede mellomrom mellom parametervariabler og deres tilordnede verdier, da dette er en vanlig feilkilde.
- Bruk gittersubtraherte bilder for standard cryo-EM-bildebehandling.
Representative Results
Etter karbonfordampningen i trinn 3.21 (vanligvis etter en uke), kan streptavidinaffinitetsrutenett brukes til klargjøring av kryo-EM eller negativ flekkprøve ved å følge prosedyrene beskrevet i trinn 4 og 5. En representativ mikrograf tatt med en K3-detektor på en titan Krios ved 81 000X forstørrelse med en pikselstørrelse på 1,05 Å av en biotinylert prøve frosset med streptavidinaffinitetsgitter er vist i figur 4A. Vellykket gitterdannelse observeres av det kontinuerlige rutenettmønsteret som vises i bakgrunnen av bildet. Dette kan lettere observeres av diffraksjonsmønsteret som vises i den raske Fourier-transformasjonen (FFT) vist i figur 4A (høyre). Etter datainnsamling, i henhold til prosedyren som er beskrevet i trinn 6 i denne protokollen, kan signalet som bidrar til bildet av streptatidingitteret, beregningsmaskeres for å produsere en subtrahert mikrograf (figur 4B) som kan brukes til påfølgende databehandlingstrinn. FFT i figur 4B (høyre) viser at diffraksjonsmønsteret observert i figur 4A (høyre) er fjernet fra det opprinnelige bildet.
Figur 4C viser en eksempelmikrograf tatt på et Tecnai 12-mikroskop med en forstørrelse på 49 000x med en pikselstørrelse på 1,6 Å av en biotinylert prøve bundet til streptavidin-affinitetsgitter og negativt farget ved hjelp av uranylformat. Rutenett ble utarbeidet etter prosedyren som er skissert i trinn 4 i denne protokollen, og etterlot en tykkere film av flekk.
Det er flere vanlige observasjoner når streptavidin-gitterfabrikasjonsprosedyren ikke lykkes, som er beskrevet nærmere i diskusjonsdelen og tabell 1. Figur 5 viser flere eksempler på disse observasjonene. Figur 5A viser en mikrograf av et negativt farget streptavidin-affinitetsrutenett brukt fra et parti laget over seks måneder gammelt. Monolaget har mobilisert fra hullene i karbonfolien i kvantifoilgitterene og observeres med lignende dimensjoner som hullene i rutenettet. Figur 5B viser et eksempel på streptavidinkrystaller med høy mosisitet som lett blir forstyrret under prøveprepareringsprosedyrer. Figur 5C viser en representativ mikrograf fra et streptavidin-affinitetsrutenett der karbonfordampningen i trinn 3.21 er for tynn eller utelatt. Streptavidingitteret har blitt fragmentert under kryo-EM-prøveprepareringsprosessen. Figur 5D viser et negativt farget streptavidin-affinitetsgitter som har forurensning fra lipidvesikler, sannsynligvis på grunn av utilstrekkelige vasker under trinn 3.13 eller at gullsiden av rutenettet blir våt under trinn 3.13-3.20. Se diskusjonsdelen og tabell 1 for strategier for å overvinne disse vanlige problemene.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av streptavidin affinity grid fabrication procedure. (A) Oversikt over tidslinje for framgangsmåten for streptavidin-affinitetsnett. Hele prosedyren kan fullføres over to uker som krever to karbonfordampningstrinn og en uke etter hver for å la karbonet eldes tilstrekkelig. (B) Zoomet i lys av et rutenett av et streptavidin-affinitetsrutenett som viser lagene som utgjør rutenettet etter fullføring av fabrikasjonsprosessen, inkludert standard kryo-EM-rutenett med gullbarrer og holey-karbonfilm, det første fordampede karbonlaget, lipidmonolag, 2D-streptapavidinkrystall og baksiden fordampet karbonstøttelag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lipidmonolag og streptapavidinkrystallisering (A) Bilder som demonstrerer hvordan man lykkes med å danne lipidmonolaget i den lille petriskålen ved å bruke talkumpulver for å skape en grense for ricinusoljen som skaper konstant overflatetrykk mens den danner lipidmonolaget. (B) Bilder som demonstrerer hvordan man dyrker streptavidinkrystaller på kryo-EM-gitter. Først berøres karbonsiden av ristene til lipidmonolaget og etterfulgt av tre påfølgende vasker i krystallisasjonsbufferen. Streptavidin tilsettes, og rister inkuberes i et fuktighetskammer i 2 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempelparametere for process_subtraction.cfg-filen for å utføre streptavidingittersubtraksjon fra mikrografer (trinn 6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av vellykket streptavidin-affinitetsnettfabrikasjon. (A) Kryo-EM-mikrografi av biotinylert protein / nukleosomkomplekser fremstilt med hjemmelagde streptavidin-affinitetsnett. FFT er vist til høyre og viser streptavidinkrystalldiffraksjonsmønsteret. (B) Samme mikrograf som i panel A vises etter gittersubtraksjonsprosedyren for å fjerne signalet fra 2D-streptapavidinkrystallet fra det opprinnelige bildet. (C) Et eksempel på en mikrograf oppnådd ved negativ farging av en biotinylert prøve bundet til streptapavidin-affinitetsgitter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av mislykket streptavidin affinitet grid fabrikasjon. (A) Mikrograf som viser mobilisering av streptavidin monolag fra gitterhullene når ristene er eldre enn seks måneder. (B) Mikrograf som viser streptavidingitter med høy mosisitet som lett blir skadet under både kryo-EM og negativ flekkprøvepreparering. (C) Mikrograf som viser fragmentering av streptapavidingitteret under klargjøring av kryo-EM-prøver når karbonfordampningslaget i trinn 3.21 er for tynt eller utelatt. (D) Representativ mikrograf som er forurenset med lipidvesikler sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig vask under trinn 3.13 eller at gullsiden av risten blir våt under trinn 3.13-3.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Feilsøkingsveiledning for å overvinne vanlige utfordringer som oppstår under mislykket streptavidin-affinitetsnettfabrikasjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende kodefil 1: lsub.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 2: process_subtration.sh Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 3: process_subtraction.cfg Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 4: bg_drill_hole.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 5: bg_FastSubtract_standard.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 7: bg_push_by_rot.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 8: ReadMRC.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodingsfil 9: WriteMRC.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodingsfil 10: WriteMRCHeader.m Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen vår beskriver hvordan man lager og bruker streptavidins affinitetsnett og hvordan man behandler dataene som inneholder streptavidindiffraksjonssignalet. Det er flere kritiske trinn i protokollen som krever spesiell oppmerksomhet.
Mislykkede rutenettpartier kan spores tilbake til flere vanlige feil. Den vanligste feilkilden kommer fra bruk av utdaterte eller dårlige reagenser. Det er spesielt viktig å fremstille den biotinylerte lipidoppløsningen nøyaktig som beskrevet i protokollen. Videre kan eventuelle urenheter, som vaskemiddelrester på labware eller naturlig tilstedeværende oljer på huden, påvirke kvaliteten på strepavidinkrystallene og dermed kvaliteten på de resulterende bildene. Det anbefales derfor å utføre tre vaskesykluser for nettene før den første karbonfordampningen for å fjerne mulig surfaktantforurensning fra nettprodusenten (trinn 2.1). I tillegg har forurensning eller urenhet av ricinusolje blitt observert å hindre krystalldannelse på rutenettet.
Å lage og plukke opp lipidmonolaget er en oppgave som bør øves noen ganger for å få en følelse av de små lipidvolumene. Det er ikke uvanlig at dette trinnet mislykkes de første to eller tre gangene før et tilstrekkelig lipidmonolag kan produseres, noe som til slutt gjenspeiles i kvaliteten på streptapavidinkrystaller som ses i negativt fargede rister (figur 4C).
Det er viktig å aldri la baksiden (gullsiden, lipidsiden) av rutenettet bli våt under rutenettfabrikasjonsprosessen (trinn 3.12-3.20). I tilfelle baksiden blir våt, anbefales det å kaste rutenettet. Dette kan resultere i store lipidvesikler som forstyrrer bildekvaliteten (figur 5D) (rad 3, tabell 1). Lipidvesikler kan også observeres på grunn av utilstrekkelig vask etter at lipidmonolaget er påført (trinn 3.13). Tre påfølgende vasker med krystallisasjonsbuffer anbefales etter berøring av lipidmonolaget før tilsetning av streptapavidin.
Etter at et tynt lag karbon har blitt fordampet på trehalose-innebygde rister, kan baksiden av rutenettet være vått uten å skade gitterkvaliteten. For eksempel observeres fukting av baksiden ofte når prøvebufferen inneholder selv minimale mengder vaskemiddel. Fukting av baksiden av prøven kan resultere i uspesifikk binding av prøver til den tynne karbonfilmen på baksiden, noe som reduserer effektiviteten ved å forhindre partikler i å diffundere til luft-vanngrensesnittet eller bruk av affinitetsbinding for rensestrategier på nettet. Hvis mulig, legg prøven til rutenettet i fravær av vaskemiddel. Vaskemiddel og andre tilsetningsstoffer kan deretter tilsettes under rutenettvasketrinnene eller tilsettes i et siste trinn før vitrifisering. Dette er en begrensning for bruken av streptavidin affinitetsnett; Men hvis målet er å forbedre preferanseorienteringen, har prøvepreparering med buffere, inkludert vaskemiddel, blitt utført vellykket11.
En vanlig feilkilde kan spores tilbake til alderen på nettene i forhold til begge karbonfordampningstrinnene (trinn 2.3 og trinn 3.21). I denne protokollen er anbefalt ventetid 5-7 dager etter karbonfordampningen på baksiden før bruk av streptavidingitter for kryo-EM. Når rister brukes for tidlig etter fabrikasjon, har gitteret og lipidmonolaget blitt observert å mobilisere ut av gitterhullene. En lignende observasjon kan gjøres når ristene er for gamle og brukes etter seks måneder (figur 5A) (rad 1, tabell 1). Vi hypoteser at denne observasjonen forklares av endringer i hydrofobiciteten til karbonstøtten som påføres for å stabilisere lipidmonolaget og streptapavidinkrystallene. I tillegg kan streptavidingitter virke mosaikk (figur 5B) (rad 3, tabell 1) og brutt i både negativ flekk og kryo-EM hvis monolaget påføres rutenett der det første karbonfordampningslaget (trinn 2.3) ikke er tilstrekkelig gammelt.
En annen vanlig feilkilde kan spores tilbake til skjørheten til streptavidinkrystallinsk monolag (lipidmonolaget er selv flytende og kan reversibelt utvide eller komprimere). Baksidens karbonfordampning (trinn 3.21) gir kritisk stabilitet til både monolaget og streptavidingitteret under prøveadsorpsjons-, vaske- og kryo-EM-blottingsprosessen. I fravær av tilstrekkelig karbonfordampning til baksiden av rutenettet, vil streptavidingitter ofte virke fragmenterte etter blotting/frysing (figur 5C) (rad 2, tabell 1). I denne protokollen foreslår vi bruk av en ensidig automatisert stupefryser for ensidig blotting. Denne metoden gir svært reproduserbare blottingsbetingelser som bevarer streptavidingitteret under fryseprosessen og muliggjør strømlinjeformet optimalisering av prøveapplikasjonen og blottingsparametrene. Alternativt har andre automatiserte stupefryseapparater blitt brukt i kombinasjon med manuell blotting. For å gjøre dette deaktiveres den faktiske blottingsfunksjonen i enhetsinnstillingene, og rutenettet blottes i stedet ved å nå med en pinsett som holder blottpapir gjennom sideoppføringen. Denne metoden kan oppnå resultater av høy kvalitet for laboratorier uten en ensidig blotting og stupefrysing; Reproduserbarhet fra nett til nett er imidlertid utfordrende.
Selv om bruk av streptavidin-affinitetsrutenett har mange fordeler, må det tas hensyn til noen begrensninger ved denne metoden. På grunn av prosedyrens art er det vanligvis ikke mulig å vurdere kvaliteten på streptapavidingitteret før hele prosessen er fullført. Det anbefales å raskt screene kvaliteten på hver batch med negativ flekk før frysing av prøver. På grunn av signalet som streptavidingitteret bidrar med til råbildene, kan det i noen tilfeller være utfordrende å vurdere, ut fra bildene alene, om det er et tilstrekkelig antall intakte, dispergerte partikler. Av samme grunn er on-the-fly behandling av kryo-EM-data under datainnsamling ikke mulig med mindre streptavidin-signalsubtraksjonsprosedyren er inkludert i dataforbehandlingsrørledningen. Fordi streptavidin-signalet vanligvis trekkes fra de bevegelseskorrigerte bildene og ikke selve rammene, kan bayesiansk polering, som implementert i populære programvarepakker, mislykkes når du bruker subtraksjonsprosedyrene som beskrevet. Det anbefales derfor å utføre bevegelseskorreksjon i flere flekker for å minimere partikkelbevegelse fra begynnelsen av databehandling16.
Til tross for disse begrensningene gir streptavidin-affinitetsrutenett mange fordeler. To store fordeler som streptavidin-affinitetsnett gir over standard kryo-EM-rutenett med åpne hull, er et middel for å beskytte prøver fra luft-vann-grensesnittet og konsentrere prøver med lav overflod (10-100 nM) på rutenettet. Andre støttelag, som karbon og grafenoksid, kan også brukes som strategier for å overvinne disse flaskehalsene for prøvepreparering. I ett eksempel var streptavidinaffinitetsnett den eneste løsningen for å oppnå en intakt rekonstruksjon av en protein-nukleinsyre-interaksjon som var uforenlig med kryssbindingsmetoder. 12
En annen stor fordel som streptavidin-affinitetsgitter gir, er en løsning på prøver som adsorberes til andre støttelag, for eksempel karbon eller grafenoksid, med foretrukne orienteringer som hindrer muligheten til å oppnå en 3D-rekonstruksjon av prøven av interesse. Tilfeldig biotinylering av prøver ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett tillater tilfeldig vedlegg av prøven av interesse til streptavidin monolaget for å oppnå flere potensielle visninger for å overvinne denne utfordringen.
I tillegg tilbyr streptavidin-affinitetsnett fordeler som er unike for affinitetsbaserte rutenett. Den høye affiniteten og spesifisiteten til streptavidin-biotin-interaksjonen tillater kobling av streptavidin-affinitetsgitter med andre arbeidsflyter som involverer biotin for å rense komplekser av interesse. I et publisert eksempel immobiliserte forfatterne et kompleks på streptavidin-affinitetsgitter og inkuberte en bindingspartner av ukjent støkiometri i stort overskudd. Etter vasking av ubundet protein ble det riktig monterte superkomplekset oppnådd og kunne umiddelbart analyseres med cryo-EM11. En mulig fremtidig anvendelse kan være å kombinere streptapavidinbindende proteinmerker, Avi-tag-systemet eller nærhetsmerkingsmetoder med streptavidin-affinitetsgitter for å trekke ut enkeltproteiner og / eller proteinkomplekser direkte fra rekombinante eller endogene kilder uten standard forseggjorte renseordninger.
Ved å tilby denne protokollen, bør laboratorier enkelt kunne reprodusere fabrikasjonen av streptavidin-affinitetsnett og etablere dem som et mer vanlig verktøy for strukturell analyse av proteinkomplekser ved kryo-EM.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
TC ble støttet av National Institute of General Medical Sciences molekylær biofysikk trening stipend GM-08295 og National Science Foundation graduate stipendiat under stipendnummer DGE 2146752. RG og BH ble støttet av National Institute of Health grant R21-GM135666 tildelt RG og BH Dette arbeidet ble delvis finansiert gjennom National Institute of General Medical Sciences stipend R35-GM127018 tildelt EN EN er en Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
