Summary
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा चुनौतीपूर्ण मैक्रोमोलेक्यूलर नमूनों के संरचनात्मक अध्ययन में उपयोग के लिए स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड बनाने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।
Abstract
स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड कई सामान्य रूप से सामना किए जाने वाले क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) नमूना तैयार करने की चुनौतियों को दूर करने के लिए रणनीति प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना विकृतीकरण और तरजीही झुकाव शामिल हैं जो हवा-पानी के इंटरफेस के कारण हो सकते हैं। स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड, हालांकि, वर्तमान में कुछ क्रायो-ईएम प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किए जाते हैं क्योंकि वे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं और सावधानीपूर्वक निर्माण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। द्वि-आयामी स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल एक बायोटिनिलेटेड लिपिड मोनोलेयर पर उगाए जाते हैं जो सीधे मानक छेद-कार्बन क्रायो-ईएम ग्रिड पर लागू होते हैं। स्ट्रेप्टाविडिन और बायोटिन के बीच उच्च-आत्मीयता बातचीत बायोटिनिलेटेड नमूनों के बाद के बंधन के लिए अनुमति देती है जो क्रायो-ईएम नमूना तैयार करने के दौरान हवा-पानी इंटरफ़ेस से सुरक्षित हैं। इसके अतिरिक्त, ये ग्रिड सीमित मात्रा में उपलब्ध नमूनों को केंद्रित करने और ग्रिड पर सीधे ब्याज के प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। यहां, क्रायो-ईएम और नकारात्मक-दाग प्रयोगों में उपयोग के लिए स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के मजबूत निर्माण के लिए एक कदम-दर-चरण, अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रेप्टाविडिन एफ़िनिटी ग्रिड के उपयोग को बड़े क्रायो-ईएम समुदाय के लिए अधिक सुलभ बनाने के लिए आमतौर पर अनुभवी चुनौतियों के लिए एक समस्या-शूटिंग गाइड शामिल किया गया है।
Introduction
इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) ने बड़े, लचीले और विषम नमूनों के मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना निर्धारण को सक्षम करके संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में क्रांति ला दी है जो पहले एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या परमाणु चुंबकीय अनुनाद1 द्वारा दुर्गम थे। यह विधि कांच की बर्फ की एक पतली परत बनाने के लिए समाधान में फ्लैश-फ्रीजिंग मैक्रोमोलेक्यूल्स द्वारा काम करती है जिसे बाद में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, माइक्रोस्कोप हार्डवेयर और इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर दोनों में महत्वपूर्ण प्रगति ने क्रायो-ईएम द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त नमूनों के प्रकारों का और विस्तार किया है।
फिर भी, पतले, विट्रिफाइड नमूनों की तैयारी क्रायो-ईएम द्वारा मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना निर्धारण में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। जैविक नमूने अक्सर गतिशील, नाजुक, विकृतीकरण के लिए प्रवण होते हैं, और कभी-कभी क्रायो-ईएम अध्ययन के लिए केवल कम मात्रा में उपलब्ध होते हैं। सोख्ता प्रक्रिया के दौरान, इन कणों कण पसंदीदा झुकाव, नाजुक परिसरों की जुदा, आंशिक या पूर्ण नमूना विकृतीकरण, औरएकत्रीकरण 2,3,4 में परिणाम कर सकते हैं जो हाइड्रोफोबिक हवा पानी इंटरफ़ेस, जो के साथ बातचीत. डिटर्जेंट या अन्य सर्फेक्टेंट का उपयोग, रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग, और परतों का समर्थन करने के लिए नमूनों का सोखना ठंड प्रक्रिया के दौरान जैविक नमूनों को संरक्षित करने के लिए सामान्य रणनीतियां हैं। ग्राफीन ऑक्साइड 5,6,7 या अनाकार कार्बन8 जैसी समर्थन परतें भी सोखना द्वारा ग्रिड पर कणों को केंद्रित करने के लिए कार्य करती हैं जब नमूना सीमित मात्रा में उपलब्ध होता है। हालांकि, ये विधियां सामान्य या विश्वसनीय नहीं हैं, और ग्रिड तैयारी का अनुकूलन बेहद समय लेने वाला या पूरी तरह से विफल हो सकता है।
स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड 9,10 इन कमियों को दूर करने और ब्याज के परिसर को अनुक्रमित करने और इसे हवा-पानी के इंटरफेस से बचाने के लिए एक हल्के और आम तौर पर लागू विधि प्रदान करने के लिए विकसित किए गए थे। ये ग्रिड ग्रिड पर बायोटिनिलेटेड लिपिड के मोनोलेयर पर उगाए गए दो-आयामी (2 डी) स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल जाली का उपयोग करते हैं। नमूनों के बाद स्वयं बायोटिनिलेटेड होते हैं (अक्सर कम और बेतरतीब ढंग से, जिसका अर्थ है औसतन प्रति कॉम्प्लेक्स एक बायोटिन), उन्हें स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित ग्रिड पर लागू किया जा सकता है। क्योंकि नमूना सोखना स्ट्रेप्टाविडिन और बायोटिन के बीच अत्यधिक उच्च संबंध पर निर्भर करता है, इन ग्रिडों के साथ 10 एनएम जितना कम नमूना सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। डीएनए युक्त परिसरों के लिए प्रोटीन और बायोटिनिलेटेड प्राइमरों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायोटिनाइलेशन किट ब्याज के अधिकांश नमूनों के लिए आवश्यक बायोटिन मोइटीज़ को संलग्न करना अपेक्षाकृत आसान बनाते हैं। नमूना ध्यान केंद्रित करने और इसे सोख्ता के दौरान हानिकारक हवा-पानी इंटरफेस से दूर रखने के अलावा, एक या सिर्फ कुछ लाइसिन अवशेषों के यादृच्छिक बायोटिनाइलेशन क्रायो-ईएम ग्रिड पर ब्याज के अणु के झुकाव की सीमा में काफी सुधार कर सकते हैं, जैसा कि कई अध्ययनों में दिखाया गयाहै 11. अंतर्निहित streptavidin क्रिस्टल से संकेत कच्चे छवियों में मौजूद है, जबकि क्रिस्टल से तेज ब्रैग प्रतिबिंब के फूरियर निस्पंदन शामिल डेटा प्रोसेसिंग योजनाओं को आसानी से जल्दी डेटा प्रोसेसिंग के दौरान हटाया जा सकता है, अंततः ब्याज 11,12,13 के नमूने के उच्च संकल्प पुनर्निर्माण को सक्षम करने. यहां, स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के मजबूत उत्पादन और क्रायो-ईएम प्रयोगों में बाद के उपयोग के लिए एक अनुकूलित, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। प्रदान प्रोटोकॉल एक 2 सप्ताह की अवधि (चित्रा 1ए) में पूरा होने की उम्मीद है. प्रोटोकॉल के पहले भाग अभिकर्मकों की तैयारी, ग्रिड के ढोंग और पहले कार्बन वाष्पीकरण चरणों का वर्णन करते हैं। अगला, निर्देश लिपिड मोनोलेयर की तैयारी और ईएम ग्रिड पर स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल की वृद्धि के लिए वर्णित हैं। इसके अतिरिक्त, नकारात्मक दाग ईएम और क्रायो-ईएम प्रयोगों में स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के उपयोग के लिए निर्देश दिए गए हैं। अंत में, क्रायो-ईएम डेटा प्राप्त करने के बाद माइक्रोग्राफ से स्ट्रेप्टाविडिन-सिग्नल को हटाने के लिए प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं।
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- क्रिस्टलीकरण बफर (50 मिमी HEPES पीएच 7.5, 150 मिमी KCl, 5 मिमी EDTA, 10% ट्रेहलोज) में 0.5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए व्यावसायिक रूप से खरीदे गए स्ट्रेप्टाविडिन को पतला करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम ट्रेहलोस एकाग्रता 10% है। तरल नाइट्रोजन में 25-50 माइक्रोन के फ्लैश-फ्रीज एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम लिपिड एकाग्रता के लिए 1,2-डिपलमिटॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन-एन- (बायोटिनिल) सोडियम नमक को 65:35:8 वी/वी/वी क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी विलायक में घोलें। कांच की शीशियों में -80 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 माइक्रोन के एकल उपयोग एलिकोट स्टोर करें।
नोट: वजन द्वारा किए जाने पर विलायक की तैयारी अधिक सटीक होती है। सबसे पहले, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) ग्रेड मेथनॉल के 6.41 ग्राम के साथ अल्ट्राप्योर पानी के 1.85 ग्राम गठबंधन करें और विलायक तैयार करने के लिए क्लोरोफॉर्म के 22.42 ग्राम में इसे जोड़ें।
चेतावनी: कृपया निर्माताओं की सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें और समझें और इस प्रोटोकॉल को शुरू करने से पहले क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल कार्बनिक सॉल्वैंट्स के हैंडलिंग और निपटान के लिए अनुशंसित निर्देश। त्वचा के साथ मेथनॉल के सीधे संपर्क से बचें।
2. ग्रिड का प्रीट्रीटमेंट
- 100% क्लोरोफॉर्म में दो बार डुबकी और 100% इथेनॉल में एक बार डुबकी लगाकर सोने की जाली ग्रिड पर कार्बन पन्नी धो लें। ग्रिड को साफ फिल्टर पेपर पर सूखने के लिए रखें। कुल तीन चक्रों के लिए धोने की प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कार्बन फ़ॉइल ग्रिड के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सफलता हासिल की गई है जिसमें 0.6-2 माइक्रोन से लेकर छेद आकार के साथ 10-12 एनएम मोटी कार्बन (सामग्री सूची देखें) की कार्बन फिल्म है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सोने की पन्नी ग्रिड और घर का बना छेद कार्बन ग्रिड Rubinstein प्रयोगशाला के nanofabrication प्रोटोकॉल14 के बाद तैयार भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्रिड के साथ कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त किए गए हैं जिनमें पतली कार्बन फिल्में हैं। तांबे के ग्रिड का उपयोग न करें, क्योंकि तांबा किसी भी कार्बनिक अमाइन के साथ प्रतिक्रिया करता है जो नमूने में हो सकता है। - ग्रिड सूखने के बाद, छेद-कार्बन ग्रिड के कार्बन पक्ष पर कार्बन की 2.5-5 एनएम मोटी परत को वाष्पित करें। कार्बन मोटाई को क्वार्ट्ज क्रिस्टल फिल्म मोटाई माप के साथ नियंत्रित किया जाता है जो सामग्री फ़ाइल की तालिका में प्रदान किए गए कार्बन बाष्पीकरणकर्ता में बनाया गया है।
- 1 सप्ताह के लिए नए वाष्पित कार्बन को उम्र (यानी, अधिक हाइड्रोफोबिक बनने) की अनुमति दें।
3. स्ट्रेप्टाविडिन जाली की तैयारी
नोट: छेददार-कार्बन ईएम ग्रिड पर 2 डी स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल विकसित करने के लिए, सबसे पहले, लैंगमुइर-शेफर ट्रांसफर द्वारा कार्बन फिल्म (चित्रा 1 बी) के छेद पर एक बायोटिनिलेटेड लिपिड मोनोलेयर लागू किया जाता है। लिपिड मोनोलेयर बाद के चरणों (चित्रा 2) के बाद बनता है। टैल्कम पाउडर अरंडी के तेल और पेट्री डिश के बीच एक सीमा बनाता है, और लिपिड मोनोलेयर बनने पर अरंडी के तेल की एक पतली परत लगातार सतह के दबाव को बनाए रखने में मदद करती है। चरण 2.2 से वाष्पित कार्बन युक्त पक्ष का उपयोग मोनोलेयर लेने के लिए किया जाता है, अतिरिक्त लिपिड क्रिस्टलीकरण बफर के साथ धोए जाते हैं, और स्ट्रेप्टाविडिन समाधान क्रिस्टलीकरण के लिए ग्रिड पर ऊष्मायन किया जाता है।
- 70% इथेनॉल के साथ बेंच क्षेत्र को साफ करें।
- साफ करने के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ कई बार एक 5 माइक्रोन ग्लास सिरिंज कुल्ला। उपयोग करने से पहले सिरिंज को पूरी तरह से सूखने दें।
- कार्बन-वाष्पित ग्रिड को फिर से धोएं, यानी, उपयोग करने से ठीक पहले, उन्हें 100% इथेनॉल में डुबोकर। ग्रिड को साफ फिल्टर पेपर पर सूखने दें।
- जबकि ग्रिड सूख रहे हैं, 100% क्लोरोफॉर्म और 100% इथेनॉल के साथ प्रत्येक विरोधी केशिका चिमटी धो लें। चिमटी को पूरी तरह से सूखने दें।
- पैराफिल्म के साफ पक्ष पर, प्रत्येक ग्रिड के लिए क्रिस्टलीकरण बफर (50 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 150 एमएम केसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 10% ट्रेहलोज) की तीन 50 माइक्रोन बूंदें तैयार करें।
- क्रिस्टलीकरण बफर (50 मिमी HEPES पीएच 7.5, 150 मिमी KCl, 5 मिमी EDTA, 10% trehalose) के साथ एक 35 मिमी uncoated पेट्री डिश के ढक्कन भरें. लेंस पेपर के साथ सतह को साफ करें।
- पेट्री डिश की परिधि के आसपास वैज्ञानिक ग्रेड टैल्कम पाउडर छिड़कें। यह बाद में एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, अगले चरण में, अरंडी का तेल कितनी दूर तक फैल गया है। एक अवरोध बनाने के लिए पर्याप्त टैल्कम पाउडर जोड़ें जो अरंडी के तेल को पेट्री डिश के किनारे को छूने से बचाता है। बहुत अधिक टैल्कम पाउडर मिलाने से लिपिड मोनोलेयर बनाने के लिए उपलब्ध स्थान सीमित हो जाता है।
- पिपेट टिप से लटका हुआ एक मध्यम आकार की बूंद (लगभग 20 माइक्रोन) प्राप्त करने के लिए अरंडी के तेल में 200 माइक्रोन विंदुक टिप डुबोएं। पेट्री डिश में बफर की सतह पर इस बूंद को स्पर्श करें, जहां यह एक समान फिल्म बनाने के लिए फैल जाएगा। तेल की परिणामी पतली फिल्म एक पिस्टन15 के रूप में कार्य करती है, जो लिपिड मोनोलेयर बनने पर एक निरंतर सतह दबाव बनाए रखती है (चरण 3.10)।
नोट: बहुत कम के बजाय पर्याप्त अरंडी का तेल जोड़ना महत्वपूर्ण है, और एक बूंद के रूप में जोड़ना बेहतर है। लिपिड मोनोलेयर बनाने से पहले अरंडी के तेल को पूरी तरह से फैलने दें। - उपयोग के लिए एक विभाज्य लेने से पहले भंग लिपिड के साथ 5 माइक्रोन ग्लास सिरिंज एक या दो बार कुल्ला। लिपिड में हवा के बुलबुले बनाने से बचें जो सिरिंज को भरता है।
नोट: ग्लास सिरिंज को भंग लिपिड के साथ धोया जाता है यदि कोई अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म चरण 3.2 से रहता है। अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म परिणामी मोनोलेयर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। - सिरिंज से लिपिड की सबसे छोटी संभव मात्रा (~ 0.5 माइक्रोन) बांटना और धीरे अरंडी के तेल फिल्म की सतह पर फांसी छोटी बूंद को छूने. ध्यान दें कि लिपिड समाधान संपर्क के बिंदु पर अरंडी के तेल की फिल्म के माध्यम से टूट जाता है और परिणामस्वरूप लिपिड मोनोलेयर अरंडी के तेल की पतली फिल्म के केंद्र में एक सर्कल बनाता है।
- क्रमिक रूप से लिपिड की कई बूंदें जोड़ें या कुछ ग्रिड बनाने के बाद अधिक लिपिड जोड़ें, लेकिन यदि बहुत अधिक जोड़ा जाता है, तो लिपिड अरंडी के तेल की सीमा से परे और परिधि में फैल जाएगा जहां टैल्कम पाउडर और किसी भी दूषित सर्फेक्टेंट को अनुक्रमित किया गया है। यदि ऐसा होता है, तो प्रक्रिया को पुनरारंभ करने की आवश्यकता होगी।
- एक एंटी-केशिका चिमटी के साथ एक ग्रिड उठाएं ताकि चिमटी की सीधी भुजा और ग्रिड के कार्बन-वाष्पित पक्ष दोनों मोनोलेयर का सामना करें।
- 1-2 एस के लिए मोनोलेयर के लिए ग्रिड के कार्बन-वाष्पित पक्ष को छूकर मोनोलेयर के हिस्से को छेद कार्बन में स्थानांतरित करें।
नोट: सफल हस्तांतरण ग्रिड की सतह हाइड्रोफिलिक बनने से संकेत मिलता है, जिससे पेट्री डिश से दूर उठाए जाने के बाद पूरे ग्रिड को कवर करने के लिए बफर की एक पतली, गोलाकार टोपी होती है। - बफर की गोलाकार टोपी को स्पर्श करें जो अब ग्रिड का पालन करता है, क्रमिक रूप से 1 एस प्रत्येक के लिए, क्रिस्टलीकरण बफर के तीन 50 माइक्रोन बूंदों के लिए जो चरण 3.5 में पैराफिल्म पर तैयार किए गए थे।
नोट: यह कदम अतिरिक्त लिपिड के जितना संभव हो उतना हटाने की कोशिश करता है, जो गोलाकार टोपी की सतह (पूर्व हाइड्रोफोबिक कार्बन फिल्म के बजाय) को कवर करता है, ताकि लिपिड पुटिकाओं के गठन से बचा जा सके जब नमूने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखे जाते हैं। - ध्यान से ग्रिड पर क्रिस्टलीकरण बफर के शेष गोलाकार टोपी में 0.5 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन के 4 माइक्रोन जोड़ें।
- ग्रिड को आर्द्रता कक्ष में रखें। ग्रिड के पूरे बैच के लिए चरण 3.11-3.14 दोहराएँ.
- वाष्पीकरण से बचने के लिए एक आर्द्रता कक्ष के अंदर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि मोनोलेयर लागू होने के बाद ग्रिड का सोना पक्ष किसी भी बिंदु पर गीला न हो। - 2 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, पैराफिल्म के साफ पक्ष पर प्रत्येक ग्रिड के लिए कुल्ला बफर (10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5, 50 एमएम केसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 10% ट्रेहलोज) की एक 300 माइक्रोन बूंद तैयार करें।
नोट: कुल्ला बफर में 150 एमएम केसीएल के बजाय 50 एमएम केसीएल होता है, जो चरण 3.5-3.6 के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रिस्टलीकरण बफर में होता है। - कुल्ला बफर के 300 माइक्रोन ड्रॉप पर ग्रिड रखकर अतिरिक्त (अनबाउंड) स्ट्रेप्टाविडिन धो लें। एक समय में एक ग्रिड के लिए 3.18-3.20 कदम प्रदर्शन करें. विस्तारित अवधि के लिए 300 माइक्रोन कुल्ला बफर ड्रॉप पर ग्रिड छोड़ने से बचें।
नोट: केवल एक धोने का प्रदर्शन किया जाता है क्योंकि इस बिंदु पर स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल/मोनोलेयर नाजुक होता है। हर बार जब एक ग्रिड को वॉश बफर की एक बूंद की सतह से दूर उठाया जाता है, तो ग्रिड और वॉश ड्रॉप के बीच का तरल पुल टूट जाता है। टूटने के समय, एक क्षणिक दबाव ढाल (चूषण दबाव) स्व-समर्थित मोनोलेयर क्रिस्टल पर लागू होता है जो कार्बन फिल्म के खुले छेद को फैलाता है। इस चूषण दबाव से मोनोलेयर क्रिस्टल के क्षणिक गुंबद का कारण बनने की उम्मीद है, साथ ही क्रिस्टल द्वारा कवर किए गए क्षेत्र का विस्तार भी होता है। यदि क्षेत्र में वृद्धि क्रिस्टल की लोचदार सीमा से अधिक है, तो क्रिस्टल फ्रैक्चर हो सकता है या अव्यवस्थित हो सकता है। - निम्नलिखित चरण में फिल्टर पेपर पर ग्रिड की रिहाई की सुविधा के लिए तुरंत एक लिंट-फ्री वाइप के साथ एंटी-केशिका चिमटी को सूखा। ड्रॉप में एंटी-केशिका चिमटी के किंक हाथ को चिपकाकर कुल्ला बफर की बूंद पर तैरने वाले ग्रिड को उठाएं।
- फिल्टर पेपर के साथ पक्ष से धीरे से अतिरिक्त बफर दूर धब्बा. सोने की तरफ नीचे फिल्टर पेपर पर ग्रिड प्लेस, प्रत्येक ग्रिड के लिए 3.18-3.20 कदम दोहराएँ, और ग्रिड 15-20 मिनट के लिए सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं.
- ग्रिड सूखने के बाद, उन्हें पलटें ताकि सोने का पक्ष अब ऊपर की ओर हो। ग्रिड के सोने की तरफ कार्बन (लगभग 0.5-2 एनएम मोटी) की एक पतली परत को वाष्पित करें।
नोट: एक निरंतर आर्द्रता पर स्टोर ग्रिड, जिसका मूल्य कोई फर्क नहीं पड़ता, यह देखते हुए कि सापेक्ष आर्द्रता में कई परिवर्तन विस्तार और संकुचन के चक्र में परिणाम की उम्मीद कर रहे हैं. सर्वोत्तम परिणामों के लिए क्रायो-ईएम उपयोग से पहले ग्रिड को 1 सप्ताह के लिए उम्र बढ़ने दें क्योंकि मोनोलेयर स्थिरता के लिए ग्रिड के पीछे की ओर की हाइड्रोफोबिसिटी महत्वपूर्ण हो सकती है। ग्रिड लंबे समय तक स्थिर रहते हैं, लेकिन 3 महीने के बाद, बैकसाइड कार्बन कम हाइड्रोफोबिक हो सकता है।
4. नकारात्मक दाग द्वारा स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड बैच गुणवत्ता की जाँच करना
- पैराफिल्म के साफ पक्ष पर 50 माइक्रोन की दो बूंदें और नमूना बफर (50 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 50 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम टीसीईपी) की 100 माइक्रोन की एक बूंद तैयार करें।
- ट्रेहलोस निकालें और दो 50 माइक्रोन बूंदों को छूकर स्ट्रेप्टाविडिन ग्रिड को फिर से हाइड्रेट करें और ग्रिड को 10 मिनट के लिए नमूना बफर के 100 माइक्रोन ड्रॉप पर तैरने दें।
नोट: पुनर्जलीकरण और बाद में नमूना-बाध्यकारी ऊष्मायन के दौरान डिटर्जेंट का उपयोग करने से बचना सबसे अच्छा है। बफर ग्रिड के सोने की तरफ फैल जाएगा और अतिरिक्त नमूनों को हटाने के लिए washes की दक्षता को सीमित करेगा। - पुनर्जलीकरण के बाद, ग्रिड को एंटी-केशिका चिमटी के साथ उठाएं ताकि एंटी-केशिका चिमटी की किंक आर्म ड्रॉप में हो।
- धीरे पक्ष से दूर अतिरिक्त बफर धब्बा और जल्दी से 75-100 एनएम नमूना (वैकल्पिक) के 4 माइक्रोन फिर से लागू.
नोट: पुनर्जलीकरण के बाद ग्रिड को सूखने देने से बचें। - 1-5 मिनट के लिए एक आर्द्रता कक्ष में नमूना सेते हैं.
नोट: एकाग्रता और इनक्यूबेशन बार नमूना निर्भर हो जाएगा और अनुकूलित किया जाना चाहिए. प्रदान की नमूना एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय शुरू अंक का सुझाव दिया है. - पैराफिल्म के साफ पक्ष पर, नमूना बफर और 1% यूरेनिल फॉर्मेट (यूएफ) दाग दोनों में से प्रत्येक में 30 माइक्रोन की चार बूंदें सेट करें।
नोट: कृपया इस चरण को करने से पहले निर्माताओं की सुरक्षा डेटा शीट और यूरेनिल फॉर्मेट के संचालन और निपटान के लिए अनुशंसित निर्देशों को पढ़ें और समझें। यूरेनिल फॉर्मेट एक विषाक्त और रेडियोधर्मी यौगिक है। रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग के लिए पूर्व संस्थागत अनुमोदन प्राप्त करना सुनिश्चित करें। - दूर खुला नमूना नमूना बफर के चार बूंदों में से प्रत्येक को छू से धो लें.
- यूएफ के साथ मानक नकारात्मक दाग प्रक्रियाओं का उपयोग कर नमूना दाग. धीरे दूर से दूर यूएफ दाग ग्रिड पर दाग की एक बहुत मोटी परत छोड़कर. यदि आवश्यक हो तो दाग को मोटा बनाने के लिए सोख्ता के बाद ग्रिड पर अतिरिक्त 0.5 माइक्रोन दाग लागू किया जा सकता है। ग्रिड को हवा में सूखने दें।
नोट: चूंकि स्ट्रेप्टाविडिन ग्रिड बहुत हाइड्रोफिलिक होते हैं, इसलिए नकारात्मक दाग हर जगह एक बहुत ही समान फिल्म बनाता है, जो आमतौर पर चमक-निर्वहन उपचारित, निरंतर कार्बन ग्रिड का उपयोग करते समय देखा जाता है। नतीजतन, दाग समाधान की एक मोटी फिल्म छोड़ने की सिफारिश की जाती है।
5. बायोटिनिलेटेड नमूनों के साथ फ्रीजिंग स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड
नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक तरफा स्वचालित सवार है जिसमें एक आंतरिक सोख्ता सेंसर होता है (अन्य स्वचालित प्लंजिंग तंत्र में एक तरफा मैनुअल सोख्ता भी संभव है) के लिए अभिप्रेत है
- पैराफिल्म के साफ पक्ष पर 50 माइक्रोन की दो बूंदें और नमूना बफर के 100 माइक्रोन की एक बूंद (जैसे, 50 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 50 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम टीसीईपी) तैयार करें।
- दो 50 माइक्रोन बूंदों को छूकर स्ट्रेप्टाविडिन ग्रिड को फिर से हाइड्रेट करें और ग्रिड को 10 मिनट के लिए नमूना बफर के 100 माइक्रोन ड्रॉप पर तैरने दें।
- पुनर्जलीकरण के बाद, ग्रिड को एंटी-केशिका चिमटी के साथ उठाएं ताकि एंटी-केशिका चिमटी की किंक आर्म ड्रॉप में हो।
- धीरे पक्ष से दूर अतिरिक्त बफर धब्बा और जल्दी से 75-100 एनएम नमूना के 4 माइक्रोन लागू होते हैं.
- 1-5 मिनट के लिए एक आर्द्रता कक्ष में नमूना सेते हैं.
नोट: फिर से, एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय नमूना-निर्भर होगा और इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए। प्रदान की नमूना एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय शुरू अंक का सुझाव दिया है. कम सांद्रता पर नमूनों के लिए, एक लंबे समय तक समय अवधि के लिए सेते हैं और/या कई बार ग्रिड के लिए नमूना बाँध कर सकते हैं. - पैराफिल्म के साफ पक्ष पर ठंड बफर (जैसे, 50 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 50 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम टीसीईपी, 3% ट्रेहलोस, 0.01% एनपी 40) की दो 10 माइक्रोन बूंदें तैयार करें। इनक्यूबेशन के बाद, ठंड बफर की पहली बूंद के लिए ग्रिड को छूकर अनबाउंड नमूना धो लें। ठंड बफर की दूसरी बूंद पर ग्रिड ड्रॉप करें.
- जल्दी से एक तरफा स्वचालित सवार से जुड़ी चिमटी के साथ ग्रिड के किनारे को पकड़ो। धीरे से अतिरिक्त बफर को मिटा दें और ग्रिड पर जल्दी से ठंड बफर (50 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 50 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम टीसीईपी, 3% ट्रेहलोज, 0.01% एनपी 40) के 4 माइक्रोन लागू करें।
- चिमटी को एक तरफा स्वचालित सवार संलग्न करें। सबसे अच्छे परिणाम एक धब्बा सेंसर का उपयोग करके प्राप्त किए गए हैं जो ग्रिड पर तरल ड्रॉप का पता लगाता है जिसमें 4-6 एस के बीच धब्बा समय होता है। उपयोग किए गए नमूने और बफर के आधार पर स्थितियां अलग-अलग होंगी।
6. स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड से एकत्र क्रायो-ईएम फिल्मों की डेटा प्रोसेसिंग
स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड पर डेटा संग्रह मानक ग्रिड के साथ के रूप में किया जा सकता है, और कोई विशेष माइक्रोस्कोप समायोजन आवश्यक नहीं हैं। हालांकि, यहां विस्तृत प्रक्रिया माइक्रोग्राफ के गति सुधार के बाद ही स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल को हटा देती है। इसलिए, डेटा प्रोसेसिंग चरण जैसे कण पॉलिशिंग जो मूल मूवी फ़्रेम पर निर्भर करते हैं, मज़बूती से नहीं किए जा सकते हैं। स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल घटाव (सीटीएफ अनुमान को छोड़कर सभी मानक डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए आवश्यक) यहां मैटलैब संस्करण आर 2014 बी या लिनक्स वातावरण पर चलने वाले नए की आवश्यकता है। सिग्नल घटाव स्ट्रेप्टाविडिन परत की क्रिस्टलीय प्रकृति पर निर्भर करता है, जो पीक मास्किंग की अनुमति देता है और इसलिए, प्रत्येक माइक्रोग्राफ के फूरियर ट्रांसफॉर्म से सिग्नल हटाने।
- प्रसंस्करण स्क्रिप्ट सेट करना
- पूरक फ़ाइलों से सभी फ़ाइलों को प्रोजेक्ट निर्देशिका के भीतर एक समर्पित फ़ोल्डर में कॉपी करें
- processing_scripts नामक एक निर्देशिका तैयार करें जिसमें निम्न फ़ाइलें शामिल हों:
lsub.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1; घटाव स्क्रिप्ट)
process_subtration.sh (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2; रैपर स्क्रिप्ट जो सभी उपलब्ध माइक्रोग्राफ पर लूप करती है, समानांतर नौकरियों को जन्म देती है, और इनपुट और आउटपुट का ट्रैक रखती है)
process_subtraction.cfg (पूरक कोडिंग फ़ाइल 3; कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल जिसमें घटाव कार्य के लिए पैरामीटर हैं, 6.2 देखें) - support_scripts नामक एक निर्देशिका तैयार करें जिसमें निम्न फ़ाइलें शामिल हों:
bg_drill_hole.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 4)
bg_FastSubtract_standard.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 6)
bg_push_by_rot.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 7)
ReadMRC.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 8)
WriteMRC.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 9)
WriteMRCHeader.m (पूरक कोडिंग फ़ाइल 10)
- कॉन्फ़िगरेशन समायोजित करें file आवश्यकतानुसार (process_subtraction.cfg, ( चित्र 3 देखें):
- इनपुट: निर्देशिका के लिए पथ जिसमें एमआरसी प्रारूप में गति-सही माइक्रोग्राफ शामिल हैं। वाइल्ड कार्ड (?, *) सहित या तो एक निर्देशिका या एक पैटर्न का उपयोग करें।
उदाहरण:
इनपुट = "/पथ/से/project_directory/माइक्रोग्राफ/"
नहीं तो
इनपुट = "/पथ/से/project_directory/माइक्रोग्राफ/*.एमआरसी" - output_dir: उस निर्देशिका का पथ जिसमें जाली घटाए गए माइक्रोग्राफ लिखे जाने चाहिए।
- only_do_unfinished: निर्दिष्ट करें (true|false) यदि पहले से मौजूद घटाए गए माइक्रोग्राफ को अधिलेखित या छोड़ दिया जाना चाहिए। यह पैरामीटर माइक्रोस्कोप सत्र (डिफ़ॉल्ट: सत्य) के बीच में जाली घटाव स्क्रिप्ट शुरू करने के लिए उपयोगी है।
- num_parallel_jobs: समानांतर कार्यों की संख्या निर्दिष्ट करें. यह संख्या प्रसंस्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले हार्डवेयर विनिर्देशों पर निर्भर करती है और उपलब्ध कोर की संख्या से अधिक नहीं होनी चाहिए। 32 कोर और एक नेटवर्क फाइल सिस्टम वाले सिस्टम पर, 14 समानांतर नौकरियों के साथ इष्टतम प्रदर्शन हासिल किया गया था। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, माइक्रोग्राफ के सबसेट के साथ इस मान को अनुकूलित करें।
- Pad_Origin_X: पोर्ट्रेट ओरिएंटेशन (छवि चौड़ाई < छवि ऊंचाई) में K3 डिटेक्टर के लिए 200 या स्क्वायर डिटेक्टर (फाल्कन III, फाल्कन IV, K2) का उपयोग करते समय, लैंडस्केप ओरिएंटेशन में K1000 डिटेक्टर के लिए 3 (छवि चौड़ाई > छवि ऊंचाई)। एफएफटी वर्ग बक्से में किया जाता है और यदि डिटेक्टर में गैर-वर्ग आयाम होते हैं तो पैडिंग की आवश्यकता होती है।
- Pad_Origin_Y: पोर्ट्रेट ओरिएंटेशन (छवि चौड़ाई < छवि ऊंचाई) में K3 डिटेक्टर के लिए 1000, स्क्वायर डिटेक्टर (फाल्कन III, फाल्कन IV, K2) का उपयोग करते समय 200 या लैंडस्केप ओरिएंटेशन (छवि चौड़ाई > छवि ऊंचाई) में K3 डिटेक्टर का उपयोग करते समय।
- Inside_Radius_Ang (90) और Outside_Radius_Ang (3.0) को न बदलें। जाली घटाव दो प्रस्तावों के बीच किया जाता है (इकाई एंगस्ट्रॉम में है)।
- Pixel_Ang: पिक्सेल आकार को फ़्लोटिंग पॉइंट मान के रूप में प्रदान करें.
- थ्रेसहोल्ड: फूरियर स्पेस में पृष्ठभूमि के साथ जाली को बदलने के लिए घटाव थ्रेशोल्ड कटऑफ मूल्य। सफलतापूर्वक उपयोग किए गए मान 1.4-1.6 के बीच हैं। प्रारंभिक बिंदु के रूप में 1.42 का उपयोग करें।
- expand_pixel (10) और pad_out_opt (0) को न बदलें। expand_pixel एक व्यास मान है जिसका उपयोग थ्रेशोल्ड कटऑफ से अधिक मूल्यों वाले पिक्सेल के आसपास मास्किंग के लिए किया जाता है। pad_out_opt एक विकल्प है जो यह तय करता है कि आउटपुट में गद्देदार क्षेत्र शामिल है या नहीं।
- addpath_m: समर्थन स्क्रिप्ट के लिए पथ।
- path_to_matlab_bin: सिस्टम की Matlab इंस्टॉलेशन बिन निर्देशिका का पथ।
- path_matlab_script: matlab substraction स्क्रिप्ट (lsub.m) के लिए पथ जिसे चरण 6.1.2 के तहत ऊपर कॉपी किया गया है।
- इनपुट: निर्देशिका के लिए पथ जिसमें एमआरसी प्रारूप में गति-सही माइक्रोग्राफ शामिल हैं। वाइल्ड कार्ड (?, *) सहित या तो एक निर्देशिका या एक पैटर्न का उपयोग करें।
- संशोधित स्क्रिप्ट को सहेजने के बाद, इनपुट माइक्रोग्राफ से स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल को घटाने के लिए स्क्रिप्ट (बैश ./process_subtraction.sh) चलाएं। स्क्रिप्ट बाधित और/या पुनरारंभ किया जा सकता है यदि पैरामीटर only_do_unfinished true पर सेट है (चरण 6.2.3 में देखें)। यदि कोई त्रुटि होती है, तो बैश स्क्रिप्ट में निर्दिष्ट पैरामीटर की समीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि पैरामीटर चर और उनके असाइन किए गए मानों के बीच कोई अनपेक्षित स्थान नहीं हैं, क्योंकि यह गलतियों का एक सामान्य स्रोत है।
- मानक क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए जाली घटाई गई छवियों का उपयोग करें।
Representative Results
चरण 3.21 (आमतौर पर एक सप्ताह के बाद) में कार्बन वाष्पीकरण के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड का उपयोग चरण 4 और 5 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद क्रायो-ईएम या नकारात्मक-दाग नमूना तैयार करने के लिए किया जा सकता है। स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के साथ जमे हुए बायोटिनिलेटेड नमूने के 1.05 ए के पिक्सेल आकार के साथ 81,000X आवर्धन पर एक टाइटन क्रिओस पर K3 डिटेक्टर का उपयोग करके कैप्चर किया गया एक प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ चित्र 4A में दिखाया गया है। छवि की पृष्ठभूमि में दिखाई देने वाले निरंतर ग्रिड पैटर्न द्वारा सफल जाली का गठन देखा जाता है। यह चित्रा 4 ए (दाएं) में दिखाए गए फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) में दिखाई देने वाले विवर्तन पैटर्न द्वारा अधिक आसानी से देखा जा सकता है। डेटा संग्रह के बाद, इस प्रोटोकॉल के चरण 6 में उल्लिखित प्रक्रिया के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन जाली द्वारा छवि में योगदान दिया गया संकेत कम्प्यूटेशनल रूप से एक घटाया माइक्रोग्राफ (चित्रा 4 बी) का उत्पादन करने के लिए नकाबपोश हो सकता है जिसका उपयोग बाद के डेटा प्रोसेसिंग चरणों के लिए किया जा सकता है। चित्रा 4 बी (दाएं) में एफएफटी से पता चलता है कि चित्रा 4 ए (दाएं) में मनाया विवर्तन पैटर्न सफलतापूर्वक मूल छवि से हटा दिया गया है।
चित्रा 4 सी स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के लिए बाध्य एक बायोटिनिलेटेड नमूने के 1.6 ए के पिक्सेल आकार के साथ 49,000x के आवर्धन पर टेक्नई 12 माइक्रोस्कोप पर लिया गया एक उदाहरण माइक्रोग्राफ दिखाता है और यूरेनिल फॉर्मेट का उपयोग करके नकारात्मक रूप से दाग दिया जाता है। ग्रिड इस प्रोटोकॉल के चरण 4 में उल्लिखित प्रक्रिया के बाद तैयार किए गए थे, दाग की एक मोटी फिल्म छोड़कर.
स्ट्रेप्टाविडिन ग्रिड निर्माण प्रक्रिया असफल होने पर कई सामान्य अवलोकन होते हैं जिन्हें चर्चा अनुभाग और तालिका 1 में आगे वर्णित किया गया है । आकृती 5 इन प्रेक्षणों के कई उदाहरण दिखाता है। चित्रा 5 ए छह महीने से अधिक पुराने बैच से उपयोग किए जाने वाले नकारात्मक रूप से दाग वाले स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड का एक माइक्रोग्राफ दिखाता है। मोनोलेयर क्वांटिफॉइल ग्रिड के कार्बन पन्नी में छेद से जुटाया गया है और ग्रिड में छेद के समान आयामों के साथ मनाया जाता है। चित्रा 5 बी स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल का एक उदाहरण दिखाता है जिसमें उच्च मोज़ेसिटी होती है जो नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं के दौरान आसानी से परेशान हो जाती है। चित्रा 5 सी एक स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड से एक प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ दिखाता है जिसमें चरण 3.21 में कार्बन वाष्पीकरण बहुत पतला या छोड़ा जाता है। क्रायो-ईएम नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान स्ट्रेप्टाविडिन जाली खंडित हो गई है। चित्रा 5 डी एक नकारात्मक दाग स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड दिखाता है जिसमें लिपिड पुटिकाओं से संदूषण होता है, संभवतः चरण 3.13 के दौरान अपर्याप्त वॉश या चरण 3.13-3.20 के दौरान ग्रिड के सोने की तरफ गीला होने के कारण। कृपया इन सामान्य मुद्दों को दूर करने की रणनीतियों के लिए चर्चा अनुभाग और तालिका 1 देखें।
चित्रा 1: स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड निर्माण प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (ए) स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड निर्माण प्रक्रिया का अवलोकन समयरेखा। पूरी प्रक्रिया को दो सप्ताह में पूरा किया जा सकता है, जिसमें दो कार्बन वाष्पीकरण चरणों की आवश्यकता होती है और प्रत्येक के एक सप्ताह बाद कार्बन को पर्याप्त रूप से उम्र की अनुमति दी जाती है। (बी) एक स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के ग्रिड वर्ग को देखते हुए ज़ूम किया गया, जो निर्माण प्रक्रिया के पूरा होने के बाद ग्रिड बनाने वाली परतों को दर्शाता है, जिसमें सोने की सलाखों और छेद-कार्बन फिल्म के साथ मानक क्रायो-ईएम ग्रिड, पहली वाष्पित कार्बन परत, लिपिड मोनोलेयर, 2 डी-स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल, और बैकसाइड वाष्पित कार्बन समर्थन परत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: लिपिड मोनोलेयर और स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टलीकरण (ए) लिपिड मोनोलेयर बनाने के दौरान निरंतर सतह दबाव बनाने वाले अरंडी के तेल के लिए एक सीमा बनाने के लिए टैल्कम पाउडर का उपयोग करके छोटे पेट्री डिश के भीतर लिपिड मोनोलेयर को सफलतापूर्वक कैसे बनाया जाए, इसका प्रदर्शन करने वाली छवियां। (बी) क्रायो-ईएम ग्रिड पर स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल विकसित करने के तरीके का प्रदर्शन करने वाली छवियां। सबसे पहले, ग्रिड के कार्बन पक्ष लिपिड मोनोलेयर को छुआ है और क्रिस्टलीकरण बफर में लगातार तीन washes द्वारा पीछा किया है. स्ट्रेप्टाविडिन जोड़ा जाता है, और ग्रिड को 2 घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: माइक्रोग्राफ (चरण 6) से स्ट्रेप्टाविडिन जाली घटाव करने के लिए process_subtraction.cfg फ़ाइल के लिए उदाहरण पैरामीटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: सफल स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड निर्माण के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) घर का बना स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के साथ तैयार बायोटिनिलेटेड प्रोटीन/न्यूक्लियोसोम परिसरों का क्रायो-ईएम माइक्रोग्राफ। एफएफटी दाईं ओर दिखाया गया है और स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल विवर्तन पैटर्न दिखाता है। (बी) पैनल ए के समान माइक्रोग्राफ मूल छवि से 2 डी स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल से सिग्नल को हटाने के लिए जाली घटाव प्रक्रिया का पालन करते हुए दिखाया गया है। (सी) स्ट्रेप्टाविडिन-आत्मीयता ग्रिड से बंधे बायोटिनिलेटेड नमूने के नकारात्मक-धुंधला से प्राप्त माइक्रोग्राफ का एक उदाहरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: असफल स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड निर्माण के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) माइक्रोग्राफ ग्रिड छेद से स्ट्रेप्टाविडिन मोनोलेयर की लामबंदी दिखा रहा है जब ग्रिड छह महीने से अधिक पुराने होते हैं। (बी) माइक्रोग्राफ उच्च मोज़ेसिटी के साथ स्ट्रेप्टाविडिन जाली दिखा रहा है जो क्रायो-ईएम और नकारात्मक-दाग नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं दोनों के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाते हैं। (सी) क्रायो-ईएम नमूना तैयार करने के दौरान स्ट्रेप्टाविडिन जाली के विखंडन को दिखाने वाला माइक्रोग्राफ जब चरण 3.21 में कार्बन वाष्पीकरण परत बहुत पतली या छोड़ी जाती है। (डी) प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ जो लिपिड पुटिकाओं से दूषित है, संभवतः चरण 3.13 के दौरान अपर्याप्त धुलाई के कारण या चरण 3.13-3.20 के दौरान ग्रिड का सोना पक्ष गीला हो जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: असफल स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड निर्माण के दौरान आने वाली आमतौर पर अनुभवी चुनौतियों को दूर करने के लिए समस्या निवारण मार्गदर्शिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: lsub.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: process_subtration.sh कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: process_subtraction.cfg कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: bg_drill_hole.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 5: bg_FastSubtract_standard.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 7: bg_push_by_rot.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 8: ReadMRC.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 9: WriteMRC.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 10: WriteMRCHeader.m कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
हमारा प्रोटोकॉल बताता है कि स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड कैसे बनाएं और उपयोग करें और स्ट्रेप्टाविडिन विवर्तन संकेत वाले डेटा को कैसे संसाधित करें। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है।
असफल ग्रिड बैचों को कई सामान्य त्रुटियों का पता लगाया जा सकता है। त्रुटि का सबसे आम स्रोत पुराने या खराब-गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों का उपयोग करने से आता है। यह बिल्कुल प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में biotinylated लिपिड समाधान तैयार करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, किसी भी अशुद्धियों, जैसे लैबवेयर पर डिटर्जेंट अवशेष या त्वचा पर स्वाभाविक रूप से मौजूद तेल, स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं और इसलिए, परिणामी छवियों की गुणवत्ता। इसलिए ग्रिड निर्माता (चरण 2.1) से संभावित सर्फेक्टेंट संदूषण को हटाने के लिए पहले कार्बन वाष्पीकरण से पहले ग्रिड के लिए तीन वाशिंग चक्र करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, अरंडी के तेल के संदूषण या अशुद्धता को ग्रिड पर क्रिस्टल गठन में बाधा डालने के लिए देखा गया है।
लिपिड मोनोलेयर बनाना और उठाना एक ऐसा कार्य है जिसे छोटे लिपिड संस्करणों के लिए महसूस करने के लिए कुछ बार अभ्यास किया जाना चाहिए। पर्याप्त लिपिड मोनोलेयर का उत्पादन करने से पहले पहले दो या तीन बार विफल होने के लिए इस कदम के लिए असामान्य नहीं है, जैसा कि अंततः स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल की गुणवत्ता में परिलक्षित होता है जो नकारात्मक रूप से सना हुआ ग्रिड(चित्रा 4सी)में देखा जाता है।
ग्रिड निर्माण प्रक्रिया (चरण 3.12-3.20) के दौरान ग्रिड के बैकसाइड (सोने की तरफ, लिपिड साइड) को कभी भी गीला नहीं होने देना महत्वपूर्ण है। यदि बैकसाइड गीला हो जाता है, तो ग्रिड को त्यागने की सिफारिश की जाती है। इसके परिणामस्वरूप बड़े लिपिड पुटिकाओं की उपस्थिति हो सकती है जो छवि गुणवत्ता(चित्रा 5डी)(पंक्ति 3, तालिका 1)को बाधित करती हैं। लिपिड मोनोलेयर लागू होने के बाद अपर्याप्त धुलाई के कारण लिपिड पुटिकाओं को भी देखा जा सकता है (चरण 3.13)। स्ट्रेप्टाविडिन जोड़ने से पहले लिपिड मोनोलेयर को छूने के बाद क्रिस्टलीकरण बफर का उपयोग करके तीन बाद के washes की सिफारिश की जाती है।
ट्रेहलोज-एम्बेडेड ग्रिड पर कार्बन की एक पतली परत वाष्पित होने के बाद, ग्रिड के पीछे की ओर जाली की गुणवत्ता को नुकसान पहुंचाए बिना गीला किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीठ का गीलापन अक्सर तब देखा जाता है जब नमूना बफर में डिटर्जेंट की न्यूनतम मात्रा भी होती है। नमूने द्वारा पीठ को गीला करने से पीछे की तरफ पतली कार्बन फिल्म के नमूनों का निरर्थक बंधन हो सकता है, जो कणों को हवा-पानी के इंटरफेस में फैलने से रोकने या ऑन-ग्रिड शुद्धि रणनीतियों के लिए आत्मीयता बाध्यकारी के उपयोग को कम करता है। यदि संभव हो तो, डिटर्जेंट की अनुपस्थिति में ग्रिड के लिए नमूना जोड़ें. डिटर्जेंट और अन्य एडिटिव्स को बाद में ग्रिड धोने के चरणों के दौरान जोड़ा जा सकता है या विट्रीफिकेशन से पहले अंतिम चरण में जोड़ा जा सकता है। यह स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के उपयोग के लिए एक सीमा है; हालांकि, अगर लक्ष्य तरजीही अभिविन्यास में सुधार करने के लिए है, डिटर्जेंट सहित बफ़र्स के साथ नमूना तैयारी, सफलतापूर्वक11 प्रदर्शन किया गया है.
त्रुटि का एक सामान्य स्रोत दोनों कार्बन वाष्पीकरण चरणों (चरण 2.3 और चरण 3.21) के सापेक्ष ग्रिड की उम्र का पता लगाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, क्रायो-ईएम के लिए स्ट्रेप्टाविडिन ग्रिड का उपयोग करने से पहले बैकसाइड कार्बन वाष्पीकरण के बाद अनुशंसित प्रतीक्षा अवधि 5-7 दिन है। जब ग्रिड का उपयोग निर्माण के तुरंत बाद किया जाता है, तो जाली और लिपिड मोनोलेयर को ग्रिड छेद से बाहर निकालने के लिए देखा गया है। एक समान अवलोकन तब किया जा सकता है जब ग्रिड बहुत पुराने होते हैं और छह महीने (चित्रा 5ए)(पंक्ति 1, तालिका 1)के बाद उपयोग किए जाते हैं। हम परिकल्पना करते हैं कि इस अवलोकन को कार्बन बैकिंग की हाइड्रोफोबिसिटी में परिवर्तन द्वारा समझाया गया है जो लिपिड मोनोलेयर और स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टल को स्थिर करने के लिए लागू होता है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रेप्टाविडिन जाली मोज़ेक (चित्रा 5 बी) (पंक्ति 3, तालिका 1) दिखाई दे सकती है और नकारात्मक-दाग और क्रायो-ईएम दोनों में टूट सकती है यदि मोनोलेयर ग्रिड पर लागू होती है जहां पहली कार्बन वाष्पीकरण परत (चरण 2.3) पर्याप्त रूप से वृद्ध नहीं है।
त्रुटि का एक अतिरिक्त सामान्य स्रोत स्ट्रेप्टाविडिन क्रिस्टलीय मोनोलेयर की नाजुकता का पता लगाया जा सकता है (लिपिड मोनोलेयर स्वयं तरल है और विपरीत रूप से विस्तार या संपीड़ित कर सकता है)। बैकसाइड कार्बन वाष्पीकरण (चरण 3.21) नमूना सोखना, धुलाई और क्रायो-ईएम सोख्ता प्रक्रिया के दौरान मोनोलेयर और स्ट्रेप्टाविडिन जाली दोनों को महत्वपूर्ण स्थिरता प्रदान करता है। ग्रिड के पीछे पर्याप्त कार्बन वाष्पीकरण की अनुपस्थिति में, स्ट्रेप्टाविडिन जाली अक्सर सोख्ता/ठंड (चित्रा 5सी)(पंक्ति 2, तालिका 1)के बाद खंडित दिखाई देगी। इस प्रोटोकॉल में, हम एक तरफा सोख्ता के लिए एक तरफा स्वचालित डुबकी फ्रीजर के उपयोग का सुझाव. यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सोख्ता स्थितियों है कि ठंड प्रक्रिया के दौरान streptavidin जाली को संरक्षित और नमूना आवेदन और सोख्ता मापदंडों के सुव्यवस्थित अनुकूलन के लिए अनुमति पैदावार. वैकल्पिक रूप से, अन्य स्वचालित डुबकी ठंड उपकरणों मैनुअल सोख्ता के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है. ऐसा करने के लिए, वास्तविक सोख्ता समारोह डिवाइस सेटिंग्स में अक्षम है, और ग्रिड पक्ष प्रविष्टि के माध्यम से सोख्ता कागज पकड़े चिमटी की एक जोड़ी के साथ तक पहुँचने के बजाय धब्बा है. यह विधि एक तरफा सोख्ता और डुबकी ठंड डिवाइस के बिना प्रयोगशालाओं के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त कर सकते हैं; हालांकि, ग्रिड-टू-ग्रिड प्रजनन क्षमता चुनौतीपूर्ण है।
स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड का उपयोग करते समय कई फायदे हैं, इस पद्धति की कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। प्रक्रिया की प्रकृति के कारण, आमतौर पर स्ट्रेप्टाविडिन जाली की गुणवत्ता का आकलन करना संभव नहीं है जब तक कि पूरी प्रक्रिया पूरी नहीं हो जाती। यह जल्दी से ठंड नमूने से पहले नकारात्मक दाग द्वारा प्रत्येक बैच की गुणवत्ता स्क्रीन करने का सुझाव दिया है. कच्चे छवियों के लिए स्ट्रेप्टाविडिन जाली द्वारा योगदान किए गए संकेत के कारण, कुछ मामलों में यह आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, अकेले छवियों से, क्या पर्याप्त संख्या में अक्षुण्ण, छितरी हुई कण हैं। इसी कारण से, डेटा अधिग्रहण के दौरान क्रायो-ईएम डेटा की ऑन-द-फ्लाई प्रोसेसिंग तब तक संभव नहीं है जब तक कि डेटा प्री-प्रोसेसिंग पाइपलाइन में स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल घटाव प्रक्रिया को शामिल नहीं किया गया हो। क्योंकि स्ट्रेप्टाविडिन सिग्नल आमतौर पर गति-सही छवियों से घटाया जाता है, न कि स्वयं फ़्रेम, बायेसियन पॉलिशिंग, जैसा कि लोकप्रिय सॉफ़्टवेयर सुइट्स में लागू किया गया है, वर्णित घटाव प्रक्रियाओं का उपयोग करते समय विफल हो सकता है। इसलिए डेटा प्रोसेसिंग16 की शुरुआत से कण आंदोलन को कम करने के लिए कई पैच में गति सुधार करने की सिफारिश की जाती है।
इन सीमाओं के बावजूद, स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड कई फायदे प्रदान करते हैं। दो प्रमुख लाभ जो स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड मानक ओपन-होल क्रायो-ईएम ग्रिड पर प्रदान करते हैं, वे हवा-पानी के इंटरफेस से नमूनों की रक्षा करने और ग्रिड पर कम बहुतायत (10-100 एनएम) के नमूनों को केंद्रित करने का एक साधन हैं। कार्बन और ग्राफीन ऑक्साइड जैसे अन्य समर्थन परतों का उपयोग इन नमूना तैयारी बाधाओं को दूर करने के लिए रणनीतियों के रूप में भी किया जा सकता है। एक उदाहरण में, स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन के एक अक्षुण्ण पुनर्निर्माण को प्राप्त करने का एकमात्र समाधान था जो क्रॉस-लिंकिंग दृष्टिकोण के साथ असंगत था। 12
एक अन्य प्रमुख लाभ जो स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड प्रदान करता है, वह नमूनों का एक समाधान है जो कार्बन या ग्राफीन ऑक्साइड जैसे अन्य समर्थन परतों को सोखता है, पसंदीदा अभिविन्यास के साथ जो ब्याज के नमूने के 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने की क्षमता में बाधा डालते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके नमूनों का यादृच्छिक बायोटिनाइलेशन इस चुनौती को दूर करने के लिए अधिक संभावित विचार प्राप्त करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन मोनोलेयर के लिए ब्याज के नमूने के यादृच्छिक लगाव की अनुमति देता है।
इसके अतिरिक्त, स्ट्रेप्टाविडिन एफ़िनिटी ग्रिड ऐसे लाभ प्रदान करते हैं जो आत्मीयता-आधारित ग्रिड के लिए अद्वितीय हैं। स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन इंटरैक्शन की उच्च आत्मीयता और विशिष्टता अन्य वर्कफ़्लोज़ के साथ स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के युग्मन की अनुमति देती है जिसमें ब्याज के परिसरों को शुद्ध करने के लिए बायोटिन शामिल होता है। एक प्रकाशित उदाहरण में, लेखकों ने स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड पर एक जटिल को स्थिर कर दिया और बड़े अतिरिक्त में अज्ञात स्टोइकोमेट्री के बाध्यकारी साथी को इनक्यूबेट किया। किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को धोने के बाद, सही ढंग से इकट्ठे सुपर-कॉम्प्लेक्स प्राप्त किया गया था और क्रायो-ईएम11 के साथ तुरंत विश्लेषण किया जा सकता था। एक संभावित भविष्य के आवेदन streptavidin बाध्यकारी प्रोटीन टैग, Avi-टैग प्रणाली, या निकटता-लेबलिंग दृष्टिकोण streptavidin आत्मीयता ग्रिड के साथ एकल प्रोटीन और / या प्रोटीन परिसरों को सीधे संयोजक या अंतर्जात स्रोतों से निकालने के लिए मानक विस्तृत शुद्धि योजनाओं के बिना गठबंधन करने के लिए हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल को प्रदान करके, प्रयोगशालाओं को स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता ग्रिड के निर्माण को आसानी से पुन: पेश करने में सक्षम होना चाहिए और उन्हें क्रायो-ईएम द्वारा प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अधिक सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले उपकरण के रूप में स्थापित करना चाहिए।
Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
टीसी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज आणविक बायोफिज़िक्स प्रशिक्षण अनुदान जीएम -08295 और अनुदान संख्या डीजीई 2146752 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। आरजी और बीएच को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान आर 21-GM135666 द्वारा समर्थित किया गया था जो आरजी और बीएच को प्रदान किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज अनुदान R35-GM127018 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, जो ईएन को प्रदान किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
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