Summary

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Abstract

Neutrophile Granulozyten sind die erste Verteidigungslinie und die am häufigsten vorkommenden Leukozyten beim Menschen. Diese Effektorzellen führen Funktionen wie Phagozytose und oxidativen Burst aus und erzeugen extrazelluläre Fallen (NETs) für die mikrobielle Clearance. Neue Erkenntnisse über die Stoffwechselaktivitäten von Neutrophilen stellen die frühe Vorstellung, dass sie in erster Linie auf Glykolyse angewiesen sind, in Frage. Durch die präzise Messung der Stoffwechselaktivitäten können unterschiedliche Stoffwechselanforderungen von Neutrophilen aufgedeckt werden, darunter der Tricarbonsäurezyklus (TCA) (auch Krebszyklus genannt), die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), der Pentosephosphatweg (PPP) und die Fettsäureoxidation (FAO) unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen. In diesem Artikel werden ein Schritt-für-Schritt-Protokoll und die Voraussetzungen für die Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung an aus dem Knochenmark der Maus, aus menschlichem Blut gewonnenen Neutrophilen und der neutrophilenähnlichen HL60-Zelllinie unter Verwendung der metabolischen Flussanalyse auf einem metabolischen extrazellulären Flussanalysator beschrieben. Diese Methode kann zur Quantifizierung der mitochondrialen Funktionen von Neutrophilen unter normalen und Krankheitsbedingungen verwendet werden.

Introduction

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle in der Zellbioenergetik, die durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt. Darüber hinaus erstreckt sich die Rolle der Mitochondrien auf die Erzeugung und Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies, die Kalziumregulierung der zytoplasmatischen und mitochondrialen Matrix, die Zellsynthese, den Katabolismus und den Transport von Metaboliten innerhalb der Zelle1. Die mitochondriale Atmung ist in allen Zellen unerlässlich, da ihre Funktionsstörung zu Stoffwechselproblemen 2 führen kann, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen3 und einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration4, Parkinson und Alzheimer5 und Charcot-Marie-Tooth-Krankheit2 A (CMT2A)6.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen an neutrophilen Granulozyten ergaben, dass es relativ wenige Mitochondrien gibt7, und sie sind für ihre Energieproduktion stark auf die Glykolyse angewiesen, da die mitochondrialen Atmungsraten sehr niedrig sind8. Mitochondrien sind jedoch entscheidend für neutrophile Funktionen, wie z. B. Chemotaxis9 und Apoptose10,11,12. Eine frühere Studie zeigte ein komplexes mitochondriales Netzwerk in menschlichen Neutrophilen mit hohem Membranpotential. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials ist ein Frühindikator für die Apoptose neutrophiler Granulozyten10. Die Behandlung mit mitochondrialem Entkoppler Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) zeigte eine signifikante Hemmung der Chemotaxis, zusammen mit einer Veränderung der mitochondrialen Morphologie 9,10.

Obwohl die primäre Energiequelle für neutrophile Granulozyten die Glykolyse ist, liefern die Mitochondrien das ATP, das die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten einleitet, indem es die erste Phase der purinergen Signalübertragung antreibt, die Ca2+-Signalübertragung verstärkt, die mitochondriale ATP-Produktion verstärkt und die funktionellen Reaktionen der neutrophilen Granulozyten auslöst13. Eine Dysfunktion der mitochondrialen Atmungskette führt zu einer übermäßigen Produktion toxischer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und zu pathogenen Schäden 14,15,16. Die NETose, d. h. der Prozess der Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für neutrophile Granulozyten, ist eine wichtige Eigenschaft von Neutrophilen, die ihnen hilft, Krankheitserreger zu bekämpfen17 und zu vielen pathologischen Zuständen beiträgt, darunter Krebs, Thrombose und Autoimmunerkrankungen18. Mitochondriale ROS tragen zur NETose19 bei, mitochondriale DNA kann ein Bestandteil von NETs18 sein, und eine veränderte mitochondriale Homöostase beeinträchtigt die NETose 20,21,22,23,24. Darüber hinaus wird während der normalen Differenzierung oder Reifung die metabolische Reprogrammierung der neutrophilen Granulozyten durch die Begrenzung der glykolytischen Aktivität umgekehrt, und sie beteiligen sich an der mitochondrialen Atmung und mobilisieren intrazelluläre Lipide25,26.

Der metabolische extrazelluläre Flussanalysator kann die mitochondriale Atmung und Glykolyse lebender Zellen kontinuierlich überwachen und quantifizieren. Der Analysator verwendet eine 96-Well-Sensorkartusche im Plattenformat und zwei Fluorophore, um die Sauerstoffkonzentration (O2) und pH-Änderungen zu quantifizieren. Die Sensorkartusche befindet sich während des Assays über der Zellmonoschicht und bildet eine ~200 nm hohe Mikrokammer. Die Lichtwellenleiterbündel im Analysator werden verwendet, um die Fluorophore anzuregen und die Änderungen der Fluoreszenzintensität zu detektieren. Änderungen derO2-Konzentration und des pH-Werts in Echtzeit werden automatisch berechnet und als Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) angezeigt. Die Sensorkartusche verfügt über vier Anschlüsse, über die während der Assay-Messungen bis zu vier Verbindungen in jede Vertiefung geladen werden können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung von Maus und menschlichen Neutrophilen sowie der neutrophilenähnlichen HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Protocol

Heparinisierte Vollblutproben wurden von gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gewonnen, die vom Institutional Review Board von UConn Health in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurde. Alle Tierversuche folgten den Richtlinien des UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), und die Genehmigung für die Verwendung von Nagetieren wurde von der UConn Health IACUC gemäß den Kriterien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labor…

Representative Results

Es wird eine repräsentative OCR-Dynamik gezeigt, die auf die mitochondrialen Atmungsänderungen als Reaktion auf Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A-Mischung aus neutrophilen Granulozyten der Maus (Abbildung 3A), humanen Neutrophilen (Abbildung 3B) und undifferenzierten und differenzierten HL60-Zellen (Abbildung 3C) hinweist. In allen Zellen senkt die Behandlung mit Oligomycin den OCR-Wert, indem der Protonenkanal der ATP-Synt…

Discussion

Das Standardverfahren, das die mitochondriale Atmung von Neutrophilen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator misst, ist durch viele Faktoren begrenzt, darunter Zellzahl, Zellwachstum und Lebensfähigkeit. Die jeweilige Substanzkonzentration variiert je nach Art und Quelle der Zellen in diesem Assay. Oligomycin und Rotenon/Antimycin A werden bei den meisten Zelltypen meist in ähnlicher Konzentration eingesetzt. Da die FCCP-induzierte maximale Atemfrequenz jedoch zwischen verschiedenen Zellen variiert, is…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Anthony T. Vella und Dr. Federica Aglianoin von der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Ausbildung im Umgang mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator und Dr. Lynn Puddington von der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Unterstützung der Instrumente. Wir danken Dr. Geneva Hargis von der UConn School of Medicine für ihre Hilfe beim wissenschaftlichen Schreiben und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), des National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 und P20GM139763), eines Start-up-Fonds von UConn Health und eines Career Re-Entry Fellowship der American Association of Immunologists unterstützt.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

Referencias

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

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