JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

Abstract

נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון והלויקוציטים הנפוצים ביותר בבני אדם. תאים משפיעים אלה מבצעים פונקציות כגון פגוציטוזה ופרץ חמצוני, ויוצרים מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) לסילוק מיקרוביאלי. תובנות חדשות על הפעילות המטבולית של נויטרופילים מאתגרות את הרעיון המוקדם שהם מסתמכים בעיקר על גליקוליזה. מדידה מדויקת של פעילויות מטבוליות יכולה לחשוף דרישות מטבוליות שונות של נויטרופילים, כולל מחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) (הידוע גם בשם מחזור קרבס), זרחן חמצוני (OXPHOS), מסלול פוספט פנטוז (PPP) וחמצון חומצות שומן (FAO) בתנאים פיזיולוגיים ובמצבי מחלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ודרישות מוקדמות למדידת קצב צריכת חמצן (OCR) כאינדיקטור לנשימה מיטוכונדריאלית על נויטרופילים שמקורם במח עצם של עכבר, נויטרופילים שמקורם בדם אנושי וקו תאים דמוי נויטרופילים מסוג HL60, תוך שימוש בניתוח שטף מטבולי על מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי. שיטה זו יכולה לשמש לכימות התפקודים המיטוכונדריאליים של נויטרופילים בתנאים נורמליים ומחלות.

Introduction

מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מרכזי בביו-אנרגטיקה של תאים, אשר מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) על-ידי זרחן חמצוני (OXPHOS). בנוסף לכך, תפקיד המיטוכונדריה משתרע על יצירה וניקוי רעלים של מיני חמצן תגובתי, ויסות סידן ציטופלזמי ומיטוכונדריאלי, סינתזה תאית, קטבוליזם והובלת מטבוליטים בתוך התא1. נשימה מיטוכונדריאלית חיונית בכל התאים, שכן תפקוד לקוי שלהם יכול לגרום לבעיות מטבוליות 2, כולל מחלות לב וכלי דם3 ומגוון רחב של מחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל4, פרקינסון ואלצהיימר5, ומחלת שארקו-מארי-שן2 A (CMT2A)6.

מחקרים מיקרוסקופיים אלקטרונים על נויטרופילים גילו שיש יחסית מעט מיטוכונדריה7, והם מסתמכים במידה רבה על גליקוליזה לייצור האנרגיה שלהם מכיוון שקצב הנשימה של המיטוכונדריה נמוך מאוד8. עם זאת, מיטוכונדריה חיוניים לתפקודי נויטרופילים, כגון כימוטקסיס9 ואפופטוזיס10,11,12. מחקר קודם חשף רשת מיטוכונדריאלית מורכבת בנויטרופילים אנושיים עם פוטנציאל ממברנה גבוה. אובדן פוטנציאלי של קרום המיטוכונדריה הוא אינדיקטור מוקדם לאפופטוזיסנויטרופילים 10. טיפול במצמד מיטוכונדריאלי קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידרזון (CCCP) הראה עיכוב משמעותי בכימוטקסיס, יחד עם שינוי במורפולוגיה המיטוכונדריאלית 9,10.

למרות שמקור האנרגיה העיקרי לנויטרופילים הוא גליקוליזה, מיטוכונדריה מספקים את ה-ATP שמתחיל את הפעלת הנויטרופילים על ידי תדלוק השלב הראשון של איתות פורינרגי, אשר מגביר את איתות Ca2+, מגביר את ייצור ה-ATP במיטוכונדריה ויוזם תגובות תפקודיות של נויטרופילים13. תפקוד לקוי של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית גורם לייצור יתר של מיני חמצן תגובתי רעיל (ROS) ומוביל לנזקים פתוגניים14,15,16. NETosis, שהוא תהליך של יצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), הוא תכונה קריטית של נויטרופילים המסייעת להם להילחם בפתוגנים17 ותורמת למצבים פתולוגיים רבים, כולל סרטן, פקקת והפרעות אוטואימוניות18. ROS שמקורו במיטוכונדריה תורם ל-NETosis19, DNA מיטוכונדריאלי יכול להיות מרכיב של NETosis18, והומאוסטזיס מיטוכונדריאלי שונה פוגע ב-NETosis 20,21,22,23,24. יתר על כן, במהלך התמיינות או הבשלה נורמלית, תכנות מחדש מטבולי של נויטרופילים מתהפך על ידי הגבלת הפעילות הגליקוליטית, והם עוסקים בנשימה מיטוכונדריאלית ומגייסים שומנים תוך תאיים25,26.

מנתח השטף החוץ-תאי המטבולי יכול לנטר ולכמת ברציפות נשימה מיטוכונדריאלית של תאים חיים וגליקוליזה. המנתח משתמש במחסנית חיישן בפורמט צלחת 96 בארות ובשני פלואורופורים כדי לכמת את ריכוז החמצן (O2) ואת שינויי ה- pH. מחסנית החיישן נמצאת מעל חד-שכבת התא במהלך הבדיקה ויוצרת מיקרו-תא בגובה ~200 ננומטר. חבילות הסיבים האופטיים באנלייזר משמשות כדי לעורר את הפלואורופורים ולזהות את השינויים בעוצמת הפלואורסצנט. שינויים בזמן אמת בריכוז O2 וב- pH מחושבים באופן אוטומטי ומוצגים כקצב צריכת חמצן (OCR) וקצב החמצה חוץ-תאי (ECAR). ישנן ארבע יציאות במחסנית החיישן המאפשרות טעינה של עד ארבע תרכובות לכל באר במהלך מדידות הבדיקה. פרוטוקול זה מתמקד בכימות הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים, כמו גם תאי HL60 דמויי נויטרופילים, באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

Protocol

דגימות דם מלא הופרינו נלקחו מתורמים אנושיים בריאים לאחר קבלת הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UConn Health בהתאם להצהרת הלסינקי. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של UConn Health (IACUC), והאישור לשימוש במכרסמים התקבל מה-UConn Health IACUC בה…

Representative Results

דינמיקה מייצגת של זיהוי תווים אופטי (OCR) מוצגת המצביעה על שינויים בנשימה המיטוכונדריאלית בתגובה לאוליגומיצין, FCCP ורוטנון/אנטימיצין תערובת של נויטרופילים של עכברים (איור 3A), נויטרופילים אנושיים (איור 3B) ותאי HL60 לא ממוינים וממוינים (איור 3C). בכ…

Discussion

ההליך הסטנדרטי המודד את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי מוגבל על ידי גורמים רבים, כולל מספר תאים, גדילת תאים וכדאיות. כל ריכוז תרכובת משתנה בין סוג ומקור התאים בבדיקה זו. אוליגומיצין ורוטנון/אנטימיצין A משמשים בעיקר בריכוז דומה בקרב רוב סוגי התאים. עם…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר אנתוני ט. ולה ולד”ר פדריקה אגליאנואין מהמחלקה לאימונולוגיה ב- UConn Health על הכשרתם בשימוש במנתח שטף חוץ-תאי מטבולי, ולד”ר לין פודינגטון מהמחלקה לאימונולוגיה ב- UConn Health על תמיכתה במכשירים. אנו מודים לד”ר ז’נבה הרגיס מבית הספר לרפואה של UConn על עזרתה בכתיבה מדעית ובעריכה של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01HL145454), המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (R35GM147713 ו- P20GM139763), קרן סטארט-אפ מ- UConn Health, ומלגת כניסה מחדש לקריירה מהאיגוד האמריקאי לאימונולוגים.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image