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Inmunología y contagio

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Abstract

Les neutrophiles sont la première ligne de défense et les leucocytes les plus abondants chez l’homme. Ces cellules effectrices remplissent des fonctions telles que la phagocytose et l’éclatement oxydatif, et créent des pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles pour la clairance microbienne. De nouvelles connaissances sur les activités métaboliques des neutrophiles remettent en question le concept initial selon lequel ils reposent principalement sur la glycolyse. La mesure précise des activités métaboliques peut révéler différentes exigences métaboliques des neutrophiles, y compris le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) (également connu sous le nom de cycle de Krebs), la phosphorylation oxydative (OXPHOS), la voie du pentose phosphate (PPP) et l’oxydation des acides gras (FAO) dans des conditions physiologiques et dans des états pathologiques. Cet article décrit un protocole étape par étape et des prérequis pour mesurer le taux de consommation d’oxygène (OCR) en tant qu’indicateur de la respiration mitochondriale sur les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse de souris, les neutrophiles dérivés du sang humain et la lignée cellulaire HL60 de type neutrophile, en utilisant l’analyse du flux métabolique sur un analyseur de flux extracellulaire métabolique. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les fonctions mitochondriales des neutrophiles dans des conditions normales et pathogènes.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle majeur dans la bioénergétique cellulaire, qui génère de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS). En plus de cela, le rôle des mitochondries s’étend à la génération et à la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, à la régulation du calcium dans la matrice cytoplasmique et mitochondriale, à la synthèse cellulaire, au catabolisme et au transport des métabolites dans la cellule1. La respiration mitochondriale est essentielle dans toutes les cellules, car leur dysfonctionnement peut entraîner des problèmes métaboliques 2, dont des maladies cardiovasculaires3 et une grande variété de maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge4, les maladies de Parkinson et d’Alzheimer5 et la maladie de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Des études de microscopie électronique sur les neutrophiles ont révélé qu’il y a relativement peu de mitochondries7, et qu’elles dépendent fortement de la glycolyse pour leur production d’énergie car les taux de respiration mitochondriale sont très faibles8. Cependant, les mitochondries sont cruciales pour les fonctions des neutrophiles, telles que la chimiotaxie9 et l’apoptose10,11,12. Une étude antérieure a révélé un réseau mitochondrial complexe dans les neutrophiles humains à fort potentiel membranaire. La perte potentielle de la membrane mitochondriale est un indicateur précoce de l’apoptose des neutrophiles10. Le traitement par découpleur mitochondrial carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP) a montré une inhibition significative de la chimiotaxie, ainsi qu’une modification de la morphologie mitochondriale 9,10.

Bien que la principale source d’énergie pour les neutrophiles soit la glycolyse, les mitochondries fournissent l’ATP qui initie l’activation des neutrophiles en alimentant la première phase de la signalisation purinergique, qui stimule la signalisation Ca2+, amplifie la production d’ATP mitochondrial et initie les réponses fonctionnelles des neutrophiles13. Le dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale entraîne une production excessive d’espèces réactives toxiques de l’oxygène (ROS) et entraîne des dommages pathogènes14,15,16. NETosis, qui est le processus de formation de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles, est une propriété essentielle des neutrophiles qui les aide à lutter contre les agents pathogènes17 et contribue à de nombreuses pathologies, y compris le cancer, la thrombose et les maladies auto-immunes18. Les ROS dérivés des mitochondries contribuent à NETosis19, l’ADN mitochondrial peut être un composant des NETs18, et l’homéostasie mitochondriale altérée altère NETosis 20,21,22,23,24. De plus, lors de la différenciation ou de la maturation normale, la reprogrammation métabolique des neutrophiles est inversée en limitant l’activité glycolytique, et ils s’engagent dans la respiration mitochondriale et mobilisent les lipides intracellulaires25,26.

L’analyseur de flux extracellulaire métabolique peut surveiller et quantifier en permanence la respiration mitochondriale et la glycolyse des cellules vivantes. L’analyseur utilise une cartouche de capteur de format plaque de 96 puits et deux fluorophores pour quantifier la concentration d’oxygène (O2) et les changements de pH. La cartouche du capteur est au-dessus de la monocouche cellulaire pendant le test et forme une microchambre de ~200 nm de haut. Les faisceaux de fibres optiques de l’analyseur sont utilisés pour exciter les fluorophores et détecter les changements d’intensité fluorescents. Les changements en temps réel de la concentration d’O2 et du pH sont automatiquement calculés et affichés sous forme de taux de consommation d’oxygène (OCR) et de taux d’acidification extracellulaire (ECAR). Il y a quatre ports sur la cartouche de capteur qui permettent de charger jusqu’à quatre composés dans chaque puits pendant les mesures de dosage. Ce protocole se concentre sur la quantification de la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humains, ainsi que des cellules HL60 de type neutrophile, à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Protocol

Des échantillons de sang total héparinés ont été prélevés sur des donneurs humains sains après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par le comité d’examen institutionnel de UConn Health conformément à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les expériences sur les animaux ont suivi les lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de UConn Health, et l’approbation de l’utilisation de rongeurs a été obtenue de l’UConn Health IACUC selon…

Representative Results

Une dynamique représentative de l’OCR indique les changements respiratoires mitochondriaux en réponse à l’oligomycine, au FCCP et au mélange roténone/antimycine A de neutrophiles de souris (Figure 3A), de neutrophiles humains (Figure 3B) et de cellules HL60 indifférenciées et différenciées (Figure 3C). Dans toutes les cellules, le traitement à l’oligomycine diminue la valeur OCR en inhibant le canal protonique de l?…

Discussion

La procédure standard qui mesure la respiration mitochondriale des neutrophiles à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique est limitée par de nombreux facteurs, notamment le nombre de cellules, la croissance cellulaire et la viabilité. La concentration de chaque composé varie selon le type et la source des cellules dans ce test. L’oligomycine et la roténone/antimycine A sont principalement utilisées à une concentration similaire dans la plupart des types de cellules. Cependant, comme la f…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Anthony T. Vella et la Dre Federica Aglianoin du Département d’immunologie de UConn Health pour leur formation à l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique, et la Dre Lynn Puddington du Département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments. Nous remercions le Dr Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour son aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (R35GM147713 et P20GM139763), d’un fonds de démarrage de UConn Health et d’une bourse de rentrée professionnelle de l’American Association of Immunologists.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
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Referencias

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
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