Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

La vaccinazione veterinaria rappresenta un aspetto cruciale della zootecnia e della salute, in quanto contribuisce a migliorare la sicurezza alimentare e il benessere degli animali conferendo protezione contro le malattie che colpiscono il settore zootecnico a livello globale¹. Un metodo efficace in vitro per valutare l’immunogenicità di possibili candidati vaccini contribuirebbe ad accelerare il processo di sviluppo e produzione del vaccino. È quindi necessario ampliare il campo dei saggi immunitari con metodologie innovative basate su studi in vitro, in quanto ciò contribuirebbe a svelare la complessità dei processi immunitari legati all’immunizzazione e all’infezione da patogeni. Attualmente, gli studi di immunizzazione e di provocazione animale in vivo , che richiedono campionamenti periodici (ad esempio, sangue e milza), vengono utilizzati per misurare l’immunogenicità dei vaccini candidati e degli adiuvanti. Questi test sono costosi, richiedono tempo e hanno implicazioni etiche, perché nella maggior parte dei casi, l’eutanasia animale viene effettuata entro la fine delle prove.

In alternativa ai test in vivo, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per valutare le risposte immunitarie indotte dal vaccino in vitro². Le PBMC sono una popolazione eterogenea di cellule composta per il 70%-90% da linfociti, per il 10%-20% da monociti e da un numero limitato di cellule dendritiche (DC, 1%-2%)³. Le PBMC ospitano cellule presentanti l’antigene (APC) come cellule B, monociti e DC, che pattugliano costantemente l’organismo alla ricerca di segni di infezione o danno tissutale. Le chemochine secrete localmente facilitano il reclutamento e l’attivazione delle APC in questi siti legandosi ai recettori della superficie cellulare. Nel caso dei monociti, le chemochine dirigono il loro destino a differenziarsi in DC o macrofagi⁴. Non appena le DC incontrano e catturano un agente patogeno, migrano verso organi linfoidi secondari, dove possono presentare gli antigeni peptidici patogeni trasformati utilizzando proteine di superficie di classe I o di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rispettivamente alle cellule T CD8+ o alle cellule T CD4⁺, innescando così una risposta immunitaria ^5,6.

Il ruolo chiave svolto dalle DC nell’orchestrare una risposta immunitaria protettiva contro vari agenti patogeni le rende un interessante obiettivo di ricerca per la comprensione dei meccanismi immunitari intracellulari, specialmente quando si progettano vaccini e adiuvanti contro agenti infettivi⁷. Poiché la frazione di DC che può essere ottenuta dalle PBMC è piuttosto piccola (1% -2%), i monociti sono stati invece utilizzati per generare DC in vitro⁸. Queste DC derivate da monociti (MoDC) sono state inizialmente sviluppate come possibile strategia di trattamento nell’immunoterapia del cancro⁹. Più recentemente, i MoDC sono stati utilizzati per la ricerca sui vaccini 10,11,12 e i monociti classici sono il sottotipo predominante (89%) per la produzione di MoDC ¹³. La produzione di MoDC in vitro è stata precedentemente ottenuta attraverso l’aggiunta del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) somministrato in combinazione con altre citochine come l’interleuchina-4 (IL-4), il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) o IL-13^14,15,16.

Il successo di un test MoDC in vitro si basa sulla capacità dei MoDC maturi stimolati dall’antigene di modulare l’estensione e il tipo di risposta immunitaria specifica per il tipo di antigene rilevato¹⁷. Il tipo di patogeno riconosciuto e presentato dalle MoDC determina la differenziazione delle cellule T helper (Th) CD4⁺ in cellule effettrici Th1, Th2 o Th17 ed è caratterizzato da un profilo di citochine secretorie specifiche per patogeno. Una risposta Th1 è suscitata contro i patogeni intracellulari e provoca la secrezione di interferone-gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale beta (TNF-β), che modula la protezione fagocitico-dipendente. Una risposta Th2 viene attivata contro gli organismi parassiti ed è caratterizzata dalla secrezione di IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, che avvia la protezione umorale fagocitica-indipendente. Th17 offre protezione neutrofili-dipendente contro le infezioni batteriche e fungine extracellulari mediate dalla secrezione di IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Sulla base di studi precedenti, è stato notato che non tutti i patogeni rientrano nel profilo di citochine atteso. Ad esempio, le MoDC dermiche, in risposta all’infezione parassitaria da Leishmania, stimolano la secrezione di IFN-γ dalle cellule T CD4+ e dalle cellule T CD8⁺, inducendo così una risposta protettiva proinfiammatoria Th1²².

È stato anche dimostrato che, nei MoDC di pollo innescati con Salmonella lipopolisaccaride (LPS), possono indurre una risposta variabile contro Salmonella typhimurium attivando sia le risposte Th1 che Th2, mentre Salmonella gallinarum induce una risposta Th2 da sola, il che potrebbe spiegare la maggiore resistenza di quest’ultima verso la clearance MoDC²³. L’attivazione di MoDC contro Brucella canis (B. canis) è stata riportata anche in MoDC sia canine che umane, il che significa che questo potrebbe rappresentare un meccanismo di infezione zoonotica²⁴. I MoDC umani innescati con B. canis inducono una forte risposta Th1 che conferisce resistenza a infezioni gravi, mentre i MoDC canini inducono una risposta Th17 dominante con una risposta Th1 ridotta, portando successivamente all’instaurazione di infezione cronica²⁵. Le MoDC bovine mostrano una maggiore affinità per il virus dell’afta epizootica (FMDV) coniugato con immunoglobuline G (IgG) rispetto all’FMDV non coniugato da solo, poiché i MoDC formano un complesso di anticorpi virali in risposta ai primi¹⁰. Nel loro insieme, questi studi mostrano come le MoDC sono state utilizzate per analizzare la complessità delle risposte immunitarie durante l’infezione da patogeni. Le risposte immunitarie adattative possono essere valutate mediante la quantificazione di specifici marcatori associati alla proliferazione linfocitaria. Ki-67, una proteina intracellulare rilevata solo nelle cellule in divisione, è considerata un marker affidabile per gli studi di proliferazione²⁶, e allo stesso modo, CD25 espresso sulla superficie delle cellule T durante la fase tardiva di attivazione corrisponde alla proliferazione linfocitaria^27,28.

Questo studio dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di MoDC per bovini seguita dalla loro applicazione in un test immunitario in vitro utilizzato per testare l’immunogenicità dei vaccini. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio (RV) è stato utilizzato per convalidare l’efficacia di questo test. L’attivazione e la proliferazione dei linfociti T sono state misurate mediante citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) attraverso l’analisi di marcatori di attivazione cellulare ben consolidati come Ki-67 e CD25 e la secrezione di IFN-γ 28,29,30,31. Durante il test MoDC non vengono eseguite prove sperimentali su animali o sull’uomo.