ウシ単球由来樹状細胞を用いたワクチン免疫原性の決定

獣医用ワクチン接種は、世界の畜産部門に影響を与える病気に対する保護を与えることにより、食料安全保障と動物福祉の改善に貢献するため、畜産と健康の重要な側面を表しています¹。可能なワクチン候補の免疫原性を評価するための効果的な in vitro 法は、ワクチンの開発と製造のプロセスを加速するのに役立ちます。したがって、 in vitro 研究に基づく革新的な方法論で免疫アッセイの分野を拡大することは、免疫化と病原体感染に関連する免疫プロセスの複雑さを明らかにするのに役立つため、必要です。現在、定期的なサンプリング(血液や脾臓など)を必要とする in vivo 動物免疫およびチャレンジ試験が、候補ワクチンおよびアジュバントの免疫原性を測定するために使用されています。これらのアッセイは高価で時間がかかり、ほとんどの場合、動物の安楽死は試験の終わりまでに行われるため、倫理的な意味があります。

in vivoアッセイの代替として、末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、in vitro²でワクチン誘導免疫応答を評価しています。PBMCは、70%〜90%のリンパ球、10%〜20%の単球、および限られた数の樹状細胞(DC、1%〜2%)で構成される不均一な細胞集団です³。PBMCには、B細胞、単球、DCなどの抗原提示細胞(APC)があり、感染や組織損傷の兆候を探して生物を常にパトロールします。局所的に分泌されるケモカインは、細胞表面受容体に結合することにより、これらの部位へのAPCの動員および活性化を促進する。単球の場合、ケモカインはDCまたはマクロファージのいずれかに分化するように運命を指示します⁴。DCが病原体に遭遇して捕獲するとすぐに、それらは二次リンパ器官に移動し、そこで主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII表面タンパク質を使用して処理された病原体ペプチド抗原をそれぞれCD8+ T細胞またはCD4⁺ T細胞に提示することができ、したがって免疫応答を引き起こす^5,6。

さまざまな病原体に対する防御免疫応答を調整する上でDCが果たす重要な役割は、特に感染性病原体に対するワクチンやアジュバントを設計する際に、細胞内免疫メカニズムを理解するための興味深い研究ターゲットになります⁷。PBMCから得ることができるDCの割合はかなり小さい(1%〜2%)ので、代わりに単球がin vitro^でDCを生成するために使用されてきました8。これらの単球由来DC(MoDC)は、当初、がん免疫療法における可能な治療戦略として開発されました⁹。最近では、MoDCがワクチン研究に使用されており10、11^、12、古典的な単球がMoDC産生の主要なサブタイプ(89%)です¹³。インビトロでのMoDCの産生は、インターロイキン-4(IL-4)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、またはIL-13などの他のサイトカインと組み合わせて与えられた顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の添加によって以前に達成されています14,15,16。

in vitro MoDCアッセイの成功は、抗原刺激成熟MoDCが検出された抗原のタイプに特異的な免疫応答の範囲とタイプを調節する能力に依存しています¹⁷。MoDCによって認識および提示される病原体の種類は、CD4⁺ Tヘルパー(Th)細胞のTh1、Th2、またはTh17エフェクター細胞への分化を決定し、病原体特異的分泌サイトカインプロファイルによって特徴付けられます。Th1応答は細胞内病原体に対して誘発され、食作用依存性保護を調節するインターフェロンガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子ベータ(TNF-β)の分泌をもたらす。Th2応答は寄生生物に対して誘発され、IL-4、IL-5、IL-10、およびIL-13分泌によって特徴付けられ、食作用に依存しない体液性保護を開始します。Th17は、IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22、およびTNF-α 18,19,20,21の分泌によって媒介される細胞外細菌および真菌感染症に対する好中球依存性の保護を提供します。以前の研究に基づいて、すべての病原体が予想されるサイトカインプロファイルに含まれるわけではないことが指摘されています。例えば、皮膚MoDCは、リーシュマニア寄生感染に応答して、CD4+ T細胞およびCD8⁺ T細胞からのIFN−γ分泌を刺激し、したがって保護的炎症誘発性Th1応答を誘導する²²。

また、サルモネラ菌リポ多糖(LPS)をプライミングしたニワトリMoDCでは、Th1応答とTh2応答の両方を活性化することにより、ネズミチフス菌に対する可変応答を誘導できることも示されていますが、サルモネラガリナラムはTh2応答のみを誘導し、MoDCクリアランス²³に対する後者のより高い耐性を説明できる可能性があります。ブルセラ・カニス(B. canis)に対するMoDCの活性化は、イヌとヒトの両方のMoDCでも報告されており、これは人獣共通感染症の感染メカニズムを表している可能性があります²⁴。B. canisでプライミングされたヒトMoDCは、重篤な感染に対する耐性を与える強力なTh1応答を誘導しますが、イヌMoDCは、Th1応答の低下を伴う優性Th17応答を誘導し、その後、慢性感染症の確立につながります²⁵。ウシMoDCは、前者¹⁰に応答してウイルス抗体複合体を形成するため、免疫グロブリンG(IgG)と結合した口蹄疫ウイルス(FMDV)に対する親和性が非結合FMDV単独と比較して増強された。まとめると、これらの研究は、病原体感染中の免疫応答の複雑さを分析するためにMoDCがどのように使用されているかを示しています。適応免疫応答は、リンパ球増殖に関連する特異的マーカーの定量化によって評価することができる。分裂細胞でのみ検出される細胞内タンパク質であるKi-67は、増殖研究の信頼できるマーカーと見なされ^ており26、同様に、活性化の後期にT細胞の表面に発現するCD25はリンパ球の増殖に対応します^27,28。

この研究は、牛MoDCのin vitro生成のための標準化された方法と、それに続くワクチンの免疫原性をテストするために使用されるin vitro免疫アッセイでのそれらの適用を示しています。市販の狂犬病ワクチン(RV)を使用して、このアッセイの有効性を検証しました。Tリンパ球の活性化と増殖は、フローサイトメトリー、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定され、Ki-67やCD25などの確立された細胞活性化マーカーの分析とIFN-γ 28,29,30,31の分泌を通じて測定されました。MoDCアッセイ中に動物または人間の実験試験は行われません。