Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial¹. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados con la inmunización y la infección por patógenos. Actualmente, la inmunización animal in vivo y los estudios de provocación, que requieren muestreos periódicos (por ejemplo, sangre y bazo), se utilizan para medir la inmunogenicidad de las vacunas candidatas y los adyuvantes. Estos ensayos son costosos, requieren mucho tiempo y tienen implicaciones éticas, porque en la mayoría de los casos, la eutanasia animal se lleva a cabo al final de los ensayos.

Como alternativa a los ensayos in vivo, se han utilizado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna in vitro². Las PBMC son una población heterogénea de células compuestas por 70%-90% de linfocitos, 10%-20% de monocitos y un número limitado de células dendríticas (DC, 1%-2%)³. Las PBMC albergan células presentadoras de antígeno (APC) como células B, monocitos y DC, que patrullan constantemente el organismo en busca de signos de infección o daño tisular. Las quimiocinas secretadas localmente facilitan el reclutamiento y la activación de APC en estos sitios al unirse a los receptores de la superficie celular. En el caso de los monocitos, las quimiocinas dirigen su destino para diferenciarse en CD o macrófagos⁴. Tan pronto como las CD encuentran y capturan un patógeno, migran a órganos linfoides secundarios, donde pueden presentar los antígenos peptídicos patógenos procesados utilizando proteínas de superficie de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a las células T CD8+ o a las células T CD4⁺, respectivamente, desencadenando así una respuesta inmune ^5,6.

El papel clave desempeñado por las CD en la orquestación de una respuesta inmune protectora contra diversos patógenos las convierte en un objetivo de investigación interesante para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, especialmente cuando se diseñan vacunas y adyuvantes contra agentes infecciosos⁷. Dado que la fracción de CD que se puede obtener de PBMC es bastante pequeña (1% -2%), los monocitos se han utilizado para generar DC in vitro⁸. Estas CD derivadas de monocitos (MoDC) se desarrollaron inicialmente como una posible estrategia de tratamiento en la inmunoterapia contra el cáncer⁹. Más recientemente, los MoDC se han utilizado para la investigación de vacunas 10,11,12^, y los monocitos clásicos son el subtipo predominante (89%) para la producción de MoDC ¹³. La producción de MoDCs in vitro se ha logrado previamente mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) administrado en combinación con otras citocinas como la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) o IL-13^14,15,16.

El éxito de un ensayo in vitro de MoDC depende de la capacidad de los MoDC maduros estimulados por antígeno para modular el alcance y el tipo de respuesta inmune específica para el tipo de antígeno detectado¹⁷. El tipo de patógeno reconocido y presentado por los MoDC determina la diferenciación de las células CD4⁺ T auxiliares (Th) en células efectoras Th1, Th2 o Th17 y se caracteriza por un perfil de citoquinas secretoras específicas del patógeno. Se provoca una respuesta Th1 contra patógenos intracelulares y da como resultado la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral beta (TNF-β), que modula la protección dependiente fagocítica. Una respuesta Th2 se desencadena contra organismos parásitos y se caracteriza por la secreción de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia la protección humoral independiente fagocítica. Th17 ofrece protección dependiente de neutrófilos contra infecciones bacterianas y fúngicas extracelulares mediadas por la secreción de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 y TNF-α 18,19,20,21. Sobre la base de estudios previos, se ha observado que no todos los patógenos caen dentro del perfil de citoquinas esperado. Por ejemplo, las MoDC dérmicas, en respuesta a la infección parasitaria por Leishmania, estimulan la secreción de IFN-γ de las células T CD4+ y las células T CD8⁺, induciendo así una respuesta Th1 proinflamatoria^{protectora 22}.

También se ha demostrado que, en pollos MoDCs preparados con lipopolisacárido de Salmonella (LPS), pueden inducir una respuesta variable contra Salmonella typhimurium activando las respuestas Th1 y Th2, mientras que Salmonella gallinarum induce una respuesta Th2 sola, lo que podría explicar la mayor resistencia de este último hacia el aclaramiento de MoDC²³. La activación de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) también ha sido reportada tanto en MoDCs caninos como humanos, lo que significa que esto podría representar un mecanismo de infección zoonótica²⁴. Las MoDC humanas preparadas con B. canis inducen una fuerte respuesta Th1 que confiere resistencia a la infección grave, mientras que las MoDC caninas inducen una respuesta Th17 dominante con una respuesta Th1 reducida, lo que posteriormente conduce al establecimiento de una infección crónica²⁵. Los MoCD bovinos muestran una mayor afinidad por el virus de la fiebre aftosa (FMDV) conjugado con inmunoglobulina G (IgG) en comparación con el FMDV no conjugado solo, ya que los MoDC forman un complejo de anticuerpos virales en respuesta a los^{10 primeros}. Tomados en conjunto, estos estudios muestran cómo se han utilizado los MoDC para analizar la complejidad de las respuestas inmunes durante la infección por patógenos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden evaluarse mediante la cuantificación de marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos. Ki-67, una proteína intracelular detectada sólo en células en división, es considerada como un marcador confiable para estudios de proliferación²⁶, y de manera similar, CD25 expresado en la superficie de las células T durante la fase tardía de activación corresponde a la proliferación de linfocitos^27,28.

Este estudio demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de MoCD de ganado vacuno seguido de su aplicación en un ensayo inmune in vitro utilizado para probar la inmunogenicidad de las vacunas. Se utilizó una vacuna antirrábica (VD) disponible comercialmente para validar la eficacia de este ensayo. La activación y proliferación de linfocitos T se midió mediante citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el análisis de marcadores de activación celular bien establecidos como Ki-67 y CD25 y la secreción de IFN-γ 28,29,30,31. No se realizan ensayos experimentales en animales o humanos durante el ensayo del MoDC.