Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

A vacinação veterinária representa um aspecto crucial da pecuária e da saúde, pois contribui para melhorar a segurança alimentar e o bem-estar animal, conferindo proteção contra doenças que afetam o setor pecuário globalmente¹. Um método in vitro eficaz para avaliar a imunogenicidade de possíveis candidatas a vacinas ajudaria a acelerar o processo de desenvolvimento e produção de vacinas. Faz-se necessário, portanto, ampliar o campo dos ensaios imunológicos com metodologias inovadoras baseadas em estudos in vitro , pois isso ajudaria a desvendar a complexidade dos processos imunes relacionados à imunização e infecção por patógenos. Atualmente, estudos de imunização animal in vivo e estudos de desafio, que requerem amostras periódicas (por exemplo, sangue e baço), são usados para medir a imunogenicidade de vacinas candidatas e adjuvantes. Esses ensaios são caros, demorados e têm implicações éticas, pois, na maioria dos casos, a eutanásia dos animais é realizada ao final dos ensaios.

Como alternativa aos ensaios in vivo, células mononucleares do sangue periférico (CMSP) têm sido utilizadas para avaliar respostas imunes induzidas por vacinas in vitro². As CMSP são uma população heterogênea de células composta por 70%-90% de linfócitos, 10%-20% de monócitos e um número limitado de células dendríticas (DCs, 1%-2%)³. As CMSP abrigam células apresentadoras de antígenos (APCs), como células B, monócitos e DCs, que patrulham constantemente o organismo em busca de sinais de infecção ou dano tecidual. As quimiocinas secretadas localmente facilitam o recrutamento e a ativação de APCs para esses locais, ligando-se a receptores de superfície celular. No caso dos monócitos, as quimiocinas direcionam seu destino para se diferenciarem em CD ou macrófagos⁴. Assim que as DCs encontram e capturam um patógeno, migram para órgãos linfoides secundários, onde podem apresentar antígenos peptídicos patogênicos processados utilizando proteínas de superfície classe I ou II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) para células T CD8+ ou células T CD4⁺, respectivamente, desencadeando uma resposta^imune5,6.

O papel fundamental desempenhado pelas DCs na orquestração de uma resposta imune protetora contra vários patógenos as torna um interessante alvo de pesquisa para a compreensão dos mecanismos imunes intracelulares, especialmente na concepção de vacinas e adjuvantes contra agentes infecciosos⁷. Como a fração de DCs que pode ser obtida a partir de CMSP é bastante pequena (1%-2%), monócitos têm sido usados para gerar CDs in vitro⁸. Essas DCs derivadas de monócitos (MoDCs) foram inicialmente desenvolvidas como uma possível estratégia de tratamento na imunoterapia do câncer⁹. Mais recentemente, as MoDCs têm sido utilizadas para pesquisa de vacinas 10,11,12^, sendo os monócitos clássicos o subtipo predominante (89%) para a produção de MoDC ¹³. A produção de MoDCs in vitro foi previamente obtida através da adição de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) administrado em combinação com outras citocinas, como interleucina-4 (IL-4), fator de necrose tumoral α (TNF-α) ou IL-13^14,15,16.

O sucesso de um ensaio in vitro de MoDC depende da capacidade das MoDCs maduras estimuladas por antígeno de modular a extensão e o tipo da resposta imune específica para o tipo de antígeno detectado¹⁷. O tipo de patógeno reconhecido e apresentado pelas MoDCs determina a diferenciação de células T helper (Th) CD4⁺ em células Th1, Th2 ou Th17 efetoras e é caracterizado por um perfil de citocinas secretoras específicas do patógeno. Uma resposta Th1 é induzida contra patógenos intracelulares e resulta na secreção de interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral beta (TNF-β), que modula a proteção fagocitária-dependente. A resposta Th2 é desencadeada contra organismos parasitários e é caracterizada pela secreção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia a proteção humoral fagocítica-independente. Th17 oferece proteção neutrofófila dependente contra infecções bacterianas e fúngicas extracelulares mediadas pela secreção de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Com base em estudos anteriores, observou-se que nem todos os patógenos se enquadram no perfil de citocinas esperado. Por exemplo, as MoDCs dérmicas, em resposta à infecção parasitária por Leishmania, estimulam a secreção de IFN-γ de células T CD4+ e células T CD8⁺, induzindo uma resposta Th1 pró-inflamatória protetora²².

Também foi demonstrado que, em MoDCs de frango preparadas com lipopolissacarídeo (LPS) de Salmonella, podem induzir uma resposta variável contra Salmonella typhimurium ativando respostas Th1 e Th2, enquanto Salmonella gallinarum induz uma resposta Th2 isoladamente, o que poderia explicar a maior resistência desta última à depuração de MoDC²³. A ativação de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) também foi relatada em MoDCs caninas e humanas, o que significa que isso poderia representar um mecanismo de infecção zoonótica²⁴. As MoDCs humanas preparadas com B. canis induzem uma forte resposta Th1 que confere resistência à infecção grave, enquanto as MoDCs caninas induzem uma resposta Th17 dominante com uma resposta Th1 reduzida, levando subsequentemente ao estabelecimento de infecção crônica²⁵. As MoDCs bovinas apresentam maior afinidade pelo vírus da febre aftosa (FMDV) conjugado com imunoglobulina G (IgG) em comparação com a FMDV não conjugada isoladamente, uma vez que as DCMs formam um complexo vírus-anticorpo em resposta às primeiras¹⁰. Em conjunto, esses estudos mostram como as MoDCs têm sido usadas para analisar a complexidade das respostas imunes durante a infecção por patógenos. As respostas imunes adaptativas podem ser avaliadas pela quantificação de marcadores específicos associados à proliferação linfocitária. O Ki-67, proteína intracelular detectada apenas em células em divisão, é considerado um marcador confiável para estudos de proliferação²⁶ e, da mesma forma, CD25 expresso na superfície das células T durante a fase tardia de ativação corresponde à proliferação linfocitária^27,28.

Este estudo demonstra um método padronizado para a geração in vitro de MoDCs bovinas seguido de sua aplicação em um ensaio imunológico in vitro utilizado para testar a imunogenicidade de vacinas. Uma vacina antirrábica (VR) comercialmente disponível foi utilizada para validar a eficácia deste ensaio. A ativação e proliferação de linfócitos T foram medidas por citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e ensaio imunoenzimático (ELISA) por meio da análise de marcadores de ativação celular bem estabelecidos, como Ki-67 e CD25, e da secreção de IFN-γ 28,29,30,31. Nenhum teste experimental em animais ou humanos é realizado durante o ensaio MoDC.