Bu çalışma, tuzlu su karides öldürücülük testi olarak da tanımlanan Artemia salina öldürücülük biyotahlil prosedürünü değerlendirmeyi ve gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu basit ve ucuz yöntem, numunelerin, yani doğal ürünlerin genel toksisitesi (ön toksisite değerlendirmesi olarak kabul edilir) hakkında bilgi verir.
Doğal ürünler antik çağlardan beri ilaç üretmek için kullanılmıştır. Günümüzde, doğal kaynaklardan elde edilen ve çok sayıda hastalığa karşı kullanılan birçok kemoterapötik ilaç bulunmaktadır. Ne yazık ki, bu bileşiklerin çoğu sıklıkla sistemik toksisite ve yan etkiler gösterir. Seçilmiş potansiyel biyoaktif örneklerin tolere edilebilirliğini daha iyi değerlendirmek için, tuzlu su karidesi (Artemia salina) genellikle öldürücülük çalışmalarında bir model olarak kullanılır. A. salina testi, çalışılan biyoaktif bileşiklerin larva evrelerinde (nauplii) mikrokabukluları öldürme yeteneğine dayanmaktadır. Bu yöntem, sitotoksisite çalışmaları ve sentetik, yarı sentetik ve doğal ürünlerin genel toksisite taraması için uygun bir başlangıç noktasını temsil eder. Yukarıda belirtilen amaçlar için genellikle uygun olan diğer birçok tahlille (in vitro hücreler veya maya suşları, zebra balığı, kemirgenler) karşılaştırıldığında basit, hızlı ve düşük maliyetli bir tahlil olarak kabul edilebilir; dahası, herhangi bir özel eğitim olmadan bile kolayca gerçekleştirilebilir. Genel olarak, A. salina testi, seçilen bileşiklerin ön toksisite değerlendirmesi ve doğal ürün ekstraktlarının biyo-rehberli fraksiyonasyonu için yararlı bir araçtır.
Bitkilerden, hayvanlardan veya mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler, çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktiviteleri nedeniyle yeni biyoaktif moleküllerin geliştirilmesinde yıllar içinde artan bir ilgi alanı olmuştur1. Bununla birlikte, ilişkili yan etkiler, ilaç direnci veya ajanların yetersiz özgüllüğü, özellikle antikanser ilaçları olarak kullanıldığında, etkisiz tedaviye yol açabilecek başlıca faktörleri temsil etmektedir 1,2.
Son birkaç on yılda, bazıları antikanser ajanları olarak kullanılan birkaç bitki kaynaklı sitotoksik ajan keşfedilmiştir 1,2,3. Bu bağlamda paklitaksel, doğal kökenli en iyi bilinen ve en aktif kemoterapötik ilaçlardan biri olarak bildirilmektedir 3,4. Şu anda, piyasadaki tüm ilaçların% 35’inden fazlasının doğal ürünlerden türetildiği veya bunlardan ilham aldığı tahmin edilmektedir5. Bu bileşiklerin potansiyel yüksek toksisitesi, tüm çalışma aşamalarında dikkate alınmasını gerektirir, çünkü farklı kirletici maddeler ve hatta bitkinin metabolik bileşenleri toksik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, yeni potansiyel bitki bazlı tedavilerin biyolojik aktivitesini ve güvenliğini değerlendirmek için ön aşamada farmakolojik ve toksikolojik profiller yapılmalıdır. Yeni biyoaktif örneklerin toksisitesini değerlendirmek için, omurgasız hayvanlar incelenecek en iyi modeller olarak düşünülebilir. Minimum etik gereklilikler talep ederler ve omurgalılarda bir sonraki test turu için en umut verici ürünlere öncelik vermek için ön in vitro testlere izin verirler 1,6.
Genellikle tuzlu su karidesi olarak bilinen A. salina, Artemia cinsine ait küçük bir halofilik omurgasızdır (Artemiidae familyası, Anostraca, subphylum Crustacea; Şekil 1). Deniz ve sucul tuzlu su ekosistemlerinde, tuzlu su karidesleri mikroalglerle beslendikleri ve balıkları beslemek için kullanılan zooplanktonun bileşenleri oldukları için önemli bir besinsel rol oynarlar. Ayrıca, larvaları (nauplii olarak bilinir), ön çalışmalarsırasında genel toksisitenin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 1,3,7.
Artemia spp. öldürücülük çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda laboratuvarda yetiştirilen nauplii’yi öldürme yeteneklerine dayanarak potansiyel olarak biyoaktif bileşiklerin toksisitesini izleyerek toksisite değerlendirmeleri için uygun bir başlangıç noktasıdır 1,8. Bu nedenle, A. salina kullanımı genel toksisite çalışmalarında cazibe kazanmıştır, çünkü hayvan modelleri9 üzerindeki diğer testlere kıyasla çok verimli ve kullanımı kolay bir yöntemdir.
Basit anatomileri, küçük boyutları ve kısa yaşam döngüleri sayesinde, çok sayıda omurgasız tek bir deneyde incelenebilir. Bu nedenle, genetik uygunluğu ve düşük maliyetli uyumluluğu büyük ölçekli taramalarla birleştirirler1. Bu bağlamda, genel bir toksisite tahlilinde tuzlu su karidesinin kullanılması, hızlı büyüme (kuluçkadan ilk sonuçlara kadar 28-72 saat gereklidir), maliyet etkinliği ve ticari yumurtaların uzun raf ömrü gibi tüm yıl boyunca kullanılabilen 3,10 gibi çeşitli avantajlar göstermektedir. Öte yandan, omurgasızlar ilkel bir organ sistemine sahip olduklarından ve adaptif bir bağışıklık sisteminden yoksun olduklarından, insan hücreleri için mükemmel ve güvenilir bir model temsil etmezler1.
Bununla birlikte, seçilen numunelerin genel toksisitesi için bir ön değerlendirme yöntemi sağlar. Ölümcül bir tahlil olarak yaygın olarak kullanıldığından, potansiyel antikanser ajanlarının toksik etkileri hakkında geçici endikasyonlar sağlayabilir. Genellikle Artemia karidesleri arasında mümkün olan en düşük ölüm oranını göstermenin gerekli olduğu diğer biyolojik aktivitelerle donatılmış bileşiklerin genel toksisitesi hakkında geri bildirim almak için de kullanılır.
Grubumuzdan devam eden bir çalışmada, Plectranthus türlerinden elde edilen farklı ekstraktlar antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteler göstermiştir (yayınlanmamış sonuçlar). Paralel olarak, ekstraktların saflaştırılmasıyla izole edilmiş bileşikler elde edildi ve daha sonra kimyasal olarak modifiye edildi. Ekstraktlar, saf bileşikler ve yarı sentetik türevler daha sonra genel toksisite açısından test edildi. Bu bağlamda, bu çalışma, Plectranthus11 cinsinin farklı bitkilerinden biyoaktif ekstraktların ve izole edilmiş bileşiklerin genel toksisitesi ve potansiyel sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi için Artemia öldürücülük biyotestinin kullanımına genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır.
Resim 1: Mikroskop altında Artemia salina . Mikroskop altında görüldüğü gibi A. salina’nın yeni yumurtadan çıkmış nauplii (büyütme 12x). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son yıllarda, bilimsel topluluk toksisite taramaları için alternatif modellere olan dikkatini artırmıştır21. A. salina öldürücülük biyotahlilinin yanı sıra, diğer metodolojiler genellikle numune tolere edilebilirliğinin değerlendirilmesi için yapılır ve omurgalı biyotahlilleri (kemirgenler gibi), omurgasızlar (zebra balığı gibi), maya suşları veya hücreleri kullanan in vitro yöntemler ve siliko yöntemler22,23,24,25<su…
The authors have nothing to disclose.
Profesör Amilcar Roberto’nun anısına.
Bu çalışma, CBIOS ve doktora hibesi SFRH / BD / 018’e (Vera Isca) atfedilen UIDB / 04567/2020 ve UIDP / 04567 / 2020 projeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a 137671 Tecnologia (FCT, Portekiz) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 | 6 mm, 250 mm |
Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |