Este trabalho tem como objetivo avaliar e revisar o procedimento de bioensaio de letalidade de Artemia salina , também identificado como ensaio de letalidade de camarão em salmoura. Este método simples e barato fornece informações sobre a toxicidade geral (considerada como uma avaliação preliminar de toxicidade) das amostras, ou seja, produtos naturais.
Os produtos naturais têm sido usados desde os tempos antigos para produzir medicamentos. Hoje em dia, existem muitas drogas quimioterápicas obtidas de fontes naturais e usadas contra uma infinidade de doenças. Infelizmente, a maioria desses compostos geralmente exibe toxicidade sistêmica e efeitos adversos. A fim de melhor avaliar a tolerabilidade de amostras potencialmente bioativas selecionadas, o camarão de salmoura (Artemia salina) é geralmente utilizado como modelo em estudos de letalidade. O teste de A. salina baseia-se na capacidade dos compostos bioativos estudados de matar os microcrustáceos em seu estágio larval (náuplios). Este método representa um ponto de partida conveniente para estudos de citotoxicidade, bem como para a triagem de toxicidade geral de produtos sintéticos, semissintéticos e naturais. Pode ser considerado um ensaio simples, rápido e de baixo custo, em comparação com muitos outros ensaios (células in vitro ou cepas de levedura , peixe-zebra, roedores) geralmente adequados para os fins acima mencionados; além disso, pode ser facilmente realizado mesmo sem qualquer treinamento específico. No geral, o ensaio de A. salina representa uma ferramenta útil para a avaliação preliminar da toxicidade de compostos selecionados e o fracionamento bioguiado de extratos de produtos naturais.
Os produtos naturais de plantas, animais ou microrganismos têm sido uma área de interesse crescente ao longo dos anos no desenvolvimento de novas moléculas bioativas devido à sua variada gama de atividades biológicas e farmacológicas1. No entanto, os efeitos colaterais associados, a resistência aos medicamentos ou a especificidade inadequada dos agentes, especialmente quando utilizados como drogas anticancerígenas, representam os principais fatores que podem levar a um tratamento ineficaz 1,2.
Nas últimas décadas, vários agentes citotóxicos derivados de plantas têm sido descobertos, alguns deles utilizados como agentes anticancerígenos 1,2,3. Nesse contexto, o paclitaxel é relatado como um dos quimioterápicos de origem natural mais conhecidos e ativos 3,4. Atualmente, estima-se que mais de 35% de todos os medicamentos no mercado são derivados ou são inspirados em produtos naturais5. A potencial alta toxicidade desses compostos requer consideração durante todas as fases do estudo, uma vez que diferentes tipos de contaminantes ou mesmo componentes metabólicos da própria planta podem causar efeitos tóxicos. Por esta razão, os perfis farmacológicos e toxicológicos devem ser realizados na fase preliminar, a fim de avaliar a atividade biológica e a segurança de novos potenciais tratamentos à base de plantas. Para avaliar a toxicidade de novas amostras bioativas, os animais invertebrados podem ser considerados como os melhores modelos a serem estudados. Exigem requisitos éticos mínimos e permitem ensaios preliminares in vitro, para priorizar os produtos mais promissores para a próxima rodada de testes em vertebrados 1,6.
A. salina é um pequeno invertebrado halofílico pertencente ao gênero Artemia (família Artemiidae, ordem Anostraca, subfilo Crustacea; Figura 1). Nos ecossistemas salinos marinhos e aquáticos, os camarões de salmoura desempenham um importante papel nutricional, pois se alimentam de microalgas e são constituintes do zooplâncton usado para alimentar peixes. Além disso, suas larvas (conhecidas como náuplios) são amplamente utilizadas na avaliação da toxicidade geral durante estudos preliminares 1,3,7.
Artemia spp. são amplamente utilizados em estudos de letalidade e também são um ponto de partida conveniente para avaliações de toxicidade, rastreando a toxicidade de compostos potencialmente bioativos com base em sua capacidade de matar náuplios cultivados em laboratório 1,8. Por esse motivo, o uso de A. salina ganhou atração em estudos gerais de toxicidade, por ser um método muito eficiente e de fácil utilização, em comparação com outros ensaios em modelos animais9.
Devido à sua anatomia simples, tamanho minúsculo e ciclo de vida curto, um grande número de invertebrados pode ser estudado em um único experimento. Como tal, combinam amenidade genética e compatibilidade de baixo custo com rastreios em larga escala1. Nesse contexto, o uso do camarão de salmoura em um ensaio geral de toxicidade apresenta diversas vantagens, como crescimento rápido (28-72 h é necessário desde a eclosão até os primeiros resultados), custo-efetividade e longa vida útil dos ovos comerciais, que podem ser utilizados durante todo o ano 3,10. Por outro lado, uma vez que os invertebrados possuem um sistema orgânico primitivo e carecem de um sistema imunológico adaptativo, eles não representam um modelo perfeito e confiável para as células humanas1.
No entanto, fornece um método de avaliação preliminar para a toxicidade geral de amostras selecionadas. Uma vez que é amplamente utilizado como um ensaio de letalidade, pode fornecer indicações provisórias sobre os efeitos tóxicos de potenciais agentes anticancerígenos. Muitas vezes também é usado para obter feedback sobre a toxicidade geral de compostos dotados de quaisquer outras atividades biológicas para as quais é essencial mostrar a menor taxa de mortalidade possível entre os camarões Artemia .
Em um estudo em andamento de nosso grupo, diferentes extratos de espécies de Plectranthus mostraram atividades antioxidantes e antimicrobianas (resultados não publicados). Paralelamente, compostos isolados foram obtidos por purificação dos extratos e então modificados quimicamente. Os extratos, compostos puros e derivados semissintéticos foram então testados em termos de toxicidade geral. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo dar uma visão geral do uso do bioensaio de letalidade Artemia para a avaliação da toxicidade geral e potencial atividade citotóxica de extratos bioativos e compostos isolados de diferentes plantas do gênero Plectranthus11.
Figura 1: Artemia salina ao microscópio. Náuplios recém-eclodidos de A. salina como visto ao microscópio (ampliação 12x). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nos últimos anos, a comunidade científica tem aumentado sua atenção para modelos alternativos para exames de toxicidade21. Além do bioensaio de letalidade de A. salina, outras metodologias são geralmente realizadas para a avaliação da tolerabilidade da amostra e incluem bioensaios de vertebrados (como roedores), invertebrados (como o peixe-zebra), métodos in vitro usando cepas ou células de levedura e métodos in silico 22,23,24,25<…
The authors have nothing to disclose.
Em memória do professor Amílcar Roberto.
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) no âmbito dos projetos UIDB/04567/2020 e UIDP/04567/2020 atribuídos ao CBIOS e à bolsa de doutoramento SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 | 6 mm, 250 mm |
Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |