يهدف هذا العمل إلى تقييم ومراجعة إجراء الفحص الحيوي للفتك بالأرتيميا ، والذي تم تحديده أيضا على أنه اختبار فتك الجمبري الملحي. توفر هذه الطريقة البسيطة والرخيصة معلومات حول السمية العامة (التي تعتبر تقييما أوليا للسمية) للعينات ، أي المنتجات الطبيعية.
تم استخدام المنتجات الطبيعية منذ العصور القديمة لإنتاج الأدوية. في الوقت الحاضر ، هناك الكثير من أدوية العلاج الكيميائي التي يتم الحصول عليها من مصادر طبيعية وتستخدم ضد عدد كبير من الأمراض. لسوء الحظ ، غالبا ما تظهر معظم هذه المركبات سمية جهازية وتأثيرات ضارة. من أجل تقييم أفضل لتحمل عينات مختارة يحتمل أن تكون نشطة بيولوجيا ، يستخدم الجمبري الملحي (Artemia salina) بشكل عام كنموذج في دراسات الفتك. يعتمد اختبار A. salina على قدرة المركبات النشطة بيولوجيا المدروسة على قتل القشريات الدقيقة في مرحلة اليرقات (nauplii). تمثل هذه الطريقة نقطة انطلاق ملائمة لدراسات السمية الخلوية ، وكذلك لفحص السمية العامة للمنتجات الاصطناعية وشبه الاصطناعية والطبيعية. يمكن اعتباره مقايسة بسيطة وسريعة ومنخفضة التكلفة ، مقارنة بالعديد من المقايسات الأخرى (الخلايا المختبرية أو سلالات الخميرة ، الزرد ، القوارض) مناسبة بشكل عام للأغراض المذكورة أعلاه ؛ علاوة على ذلك ، يمكن إجراؤه بسهولة حتى بدون أي تدريب محدد. بشكل عام ، تمثل مقايسة A. salina أداة مفيدة لتقييم السمية الأولية للمركبات المختارة والتجزئة الموجهة بيولوجيا لمستخلصات المنتجات الطبيعية.
كانت المنتجات الطبيعية من النباتات أو الحيوانات أو الكائنات الحية الدقيقة مجال اهتمام متزايد على مر السنين في تطوير جزيئات نشطة بيولوجيا جديدة بسبب مجموعتها المتنوعة من الأنشطة البيولوجية والدوائية1. ومع ذلك ، فإن الآثار الجانبية المرتبطة ، أو مقاومة الأدوية ، أو عدم كفاية خصوصية العوامل ، خاصة عند استخدامها كأدوية مضادة للسرطان ، تمثل العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤدي إلى علاج غير فعال 1,2.
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم اكتشاف العديد من العوامل السامة للخلايا المشتقة من النباتات ، بعضها يستخدم كعوامل مضادة للسرطان1،2،3. في هذا السياق ، تم الإبلاغ عن باكليتاكسيل كواحد من أشهر أدوية العلاج الكيميائي وأكثرها نشاطا من أصل طبيعي 3,4. حاليا ، تشير التقديرات إلى أن أكثر من 35 ٪ من جميع الأدوية في السوق مشتقة من أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية5. تتطلب السمية العالية المحتملة لهذه المركبات النظر فيها خلال جميع مراحل الدراسة ، لأن الأنواع المختلفة من الملوثات أو حتى المكونات الأيضية للنبات نفسه يمكن أن تسبب تأثيرات سامة. لهذا السبب ، ينبغي إجراء الملامح الدوائية والسمية في المرحلة الأولية ، لتقييم النشاط البيولوجي وسلامة العلاجات النباتية المحتملة الجديدة. لتقييم سمية العينات النشطة بيولوجيا الجديدة ، يمكن اعتبار الحيوانات اللافقارية أفضل النماذج للدراسة. إنهم يطالبون بحد أدنى من المتطلبات الأخلاقية ويسمحون بإجراء فحوصات أولية في المختبر ، لإعطاء الأولوية للمنتجات الواعدة للجولة التالية من الاختبار في الفقاريات 1,6.
يعرف A. salina باسم الجمبري الملحي ، وهو عبارة عن لافقاريات صغيرة محبة للملح تنتمي إلى جنس Artemia (عائلة Artemiidae ، رتبة Anostraca ، subphylum Crustacea. الشكل 1). وفي النظم الإيكولوجية البحرية والمائية المالحة، يلعب الجمبري المالح دورا غذائيا هاما لأنه يتغذى على الطحالب الدقيقة وهو أحد مكونات العوالق الحيوانية المستخدمة لتغذية الأسماك. علاوة على ذلك ، تستخدم يرقاتها (المعروفة باسم nauplii) على نطاق واسع في تقييم السمية العامة خلال الدراسات الأولية1،3،7.
الأرتيميا spp. تستخدم على نطاق واسع في دراسات الفتك وهي أيضا نقطة انطلاق ملائمة لتقييم السمية ، من خلال تتبع سمية المركبات النشطة بيولوجيا المحتملة بناء على قدرتها على قتل nauplii المزروعة في المختبر 1,8. لهذا السبب ، اكتسب استخدام A. salina جاذبية في دراسات السمية العامة ، لأنها طريقة فعالة للغاية وسهلة الاستخدام ، مقارنة بالاختبارات الأخرى على النماذج الحيوانية9.
نظرا لتشريحها البسيط وحجمها الصغير ودورة حياتها القصيرة ، يمكن دراسة عدد كبير من اللافقاريات في تجربة واحدة. على هذا النحو ، فإنها تجمع بين قابلية الملاءمة الوراثية والتوافق منخفض التكلفة مع الفحوصات واسعة النطاق1. في هذا السياق ، يظهر استخدام الجمبري الملحي في مقايسة السمية العامة العديد من المزايا ، مثل النمو السريع (هناك حاجة إلى 28-72 ساعة من الفقس إلى النتائج الأولى) ، والفعالية من حيث التكلفة ، والعمر الافتراضي الطويل للبيض التجاري ، والتي يمكن استخدامها على مدار السنة 3,10. من ناحية أخرى ، نظرا لأن اللافقاريات لديها نظام عضوي بدائي وتفتقر إلى نظام المناعة التكيفي ، فإنها لا تمثل نموذجا مثاليا وموثوقا للخلايا البشرية1.
ومع ذلك ، فإنه يوفر طريقة تقييم أولية للسمية العامة للعينات المختارة. نظرا لأنه يستخدم على نطاق واسع كاختبار مميت ، فإنه يمكن أن يوفر مؤشرات مؤقتة حول التأثيرات السامة للعوامل المضادة للسرطان المحتملة. وغالبا ما يستخدم أيضا للحصول على تغذية مرتدة حول السمية العامة للمركبات التي تتمتع بأي أنشطة بيولوجية أخرى من الضروري إظهار أدنى معدل نفوق ممكن بين جمبري الأرتيميا .
في دراسة مستمرة من مجموعتنا ، أظهرت مقتطفات مختلفة من أنواع Plectranthus أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للميكروبات (نتائج غير منشورة). في موازاة ذلك ، تم الحصول على المركبات المعزولة عن طريق تنقية المستخلصات ثم تم تعديلها كيميائيا. ثم تم اختبار المستخلصات والمركبات النقية والمشتقات شبه الاصطناعية من حيث السمية العامة. في هذا السياق ، يهدف هذا العمل إلى إعطاء لمحة عامة عن استخدام المقايسة الحيوية الفتاكة الأرتيميا لتقييم السمية العامة والنشاط السام للخلايا المحتمل للمستخلصات النشطة بيولوجيا والمركبات المعزولة من نباتات مختلفة من جنس Plectranthus11.
الشكل 1: الأرتيميا المالحة تحت المجهر. nauplii حديث الفقس من A. salina كما يظهر تحت المجهر (التكبير 12x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
خلال السنوات الأخيرة ، زاد المجتمع العلمي من اهتمامه بالنماذج البديلة لفحوصات السمية21. بجانب الفحص الحيوي لفتك A. salina ، عادة ما يتم إجراء منهجيات أخرى لتقييم تحمل العينات وتشمل المقايسات الحيوية للفقاريات (مثل القوارض) ، واللافقاريات (مثل الزرد) ، والطرق المختبرية ب?…
The authors have nothing to disclose.
في ذكرى البروفيسور أميلكار روبرتو.
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT ، البرتغال) في إطار المشروعين UIDB / 04567/2020 و UIDP / 04567/2020 المنسوبين إلى CBIOS ومنحة الدكتوراه SFRH / BD / 137671/2018 (Vera Isca).
24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 | 6 mm, 250 mm |
Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |