Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Die Gentherapie unter Verwendung von Adeno-assoziierten Virus (AAV) -Vektoren hat in den letzten drei Jahrzehnten große Fortschritte gemacht^1,2. Nachgewiesene Verbesserungen bei einer Vielzahl von genetischen Erkrankungen, einschließlich angeborener Blindheit, Hämophilie und Erkrankungen des Bewegungsapparates und des zentralen Nervensystems, haben die AAV-Gentherapie an die Spitze der klinischen Forschung gebracht^3,4. Im Jahr 2012 genehmigte die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) Glybera, einen AAV1-Vektor, der Lipoproteinlipase (LPL) zur Behandlung von LPL-Mangel exprimiert, und ist damit die erste Marktzulassung für eine Gentherapie in Europa oder den Vereinigten Staaten⁵. Seitdem haben zwei weitere AAV-Gentherapien, Luxturna⁶ und Zolgensma^7,die FDA-Zulassung erhalten, und es wird erwartet, dass der Markt in den nächsten 5 Jahren mit bis zu 10-20 Gentherapien, die bis 2025 erwartet werden, schnell expandieren^{wird 8}. Verfügbare klinische Daten deuten darauf hin, dass die AAV-Gentherapie eine sichere, gut verträgliche und wirksame Modalität ist, die sie zu einem der vielversprechendsten viralen Vektoren macht, mit über 244 klinischen Studien mit AAV, die bei ClinicalTrials.gov registriert wurden. Das zunehmende Interesse an klinischen Anwendungen mit AAV-Vektoren erfordert robuste und skalierbare Produktionsmethoden, um die Bewertung von AAV-Therapien in Großtiermodellen zu erleichtern, da dies ein kritischer Schritt in der translationalen Pipeline^{ist 9}.

Für die AAV-Vektorproduktion sind die beiden Hauptanforderungen das AAV-Genom und das Kapsid. Das Genom des Wildtyps (wt)-AAV ist eine einzelsträngige DNA mit einer Länge von etwa 4,7 kb^10. Das wt-AAV-Genom umfasst invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) an beiden Enden des Genoms, die für die Verpackung wichtig sind, sowie die Rep- und Cap-Gene ¹¹. Die Rep- und Cap-Gene, die für die Genomreplikation, die Assemblierung des viralen Kapsids und die Verkapselung des Genoms in das virale Kapsid notwendig sind, werden aus dem viralen Genom entfernt und in trans für die AAV-Vektorproduktion^{bereitgestellt 12}. Die Entfernung dieser Gene aus dem viralen Genom bietet Raum für therapeutische Transgene und alle notwendigen regulatorischen Elemente, einschließlich des Promotors und des PolyA-Signals. Die ITRs verbleiben im Vektorgenom, um eine ordnungsgemäße Genomreplikation und Virusverkapselung zu gewährleisten^13,14. Um die Kinetik der Transgenexpression zu verbessern, können AAV-Vektorgenome so konstruiert werden, dass sie selbstkomplementär sind, was die Notwendigkeit einer Umwandlung von einzelsträngiger zu doppelsträngiger DNA-Umwandlung während der AAV-Genomreplikation verringert, aber die Kodierungskapazität auf ~ 2,4 kb¹⁵reduziert.

Über das AAV-Genomdesign hinaus bestimmt die Auswahl des Kapsidserotyps den Gewebe- und Zelltropismus des AAV-Vektors in vivo². Zusätzlich zum Gewebetropismus wurde gezeigt, dass verschiedene AAV-Serotypen unterschiedliche Genexpressionskinetik aufweisen¹⁶. Zum Beispiel klassifizierten Zincarelli et al.¹⁷ verschiedene AAV-Serotypen in Serotypen mit niedriger Expression (AAV2, 3, 4, 5), Serotypen mit moderater Expression (AAV1, 6, 8) und Serotypen mit hoher Expression (AAV7 und 9). Sie kategorisierten auch AAV-Serotypen in langsam einsetzende Expression (AAV2, 3, 4, 5) oder schnell einsetzende Expression (AAV1, 6, 7, 8 und 9). Diese divergierenden Tropismen und Genexpressionskinetik sind auf Aminosäurevariationen in den Kapsidproteinen, Kapsidproteinbildungen und Wechselwirkungen mit Wirtszellrezeptoren / Co-Rezeptoren zurückzuführen¹⁸. Einige AAV-Kapside haben zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften wie die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke nach intravaskulärer Verabreichung (AAV9) zu überwinden oder sich in langlebigen Muskelzellen für eine dauerhafte Transgenexpression zu befinden (AAV6, 6.2FF, 8 und 9)^19,20.

Dieser Artikel zielt darauf ab, eine kostengünstige Methode zur Herstellung von hochreinen, hochtiterhaltigen AAV-Vektoren in Forschungsqualität für den Einsatz in präklinischen Großtiermodellen zu beschreiben. Die Produktion von AAV unter Verwendung dieses Protokolls wird durch Dual-Plasmid-Transfektion in adhärente menschliche embryonale Nieren (HEK) 293 Zellen erreicht, die in Zellstapeln gezüchtet werden. Darüber hinaus beschreibt die Studie ein Protokoll zur Aufreinigung der Heparinsulfataffinitätschromatographie, das für AAV-Serotypen verwendet werden kann, die Heparin-bindende Domänen enthalten, einschließlich AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 und DJ^21,22.

Für die Herstellung von AAV-Vektoren stehen eine Reihe von Verpackungssystemen zur Verfügung. Unter diesen hat die Verwendung eines Zwei-Plasmid-Co-Transfektionssystems, bei dem die Rep- und Cap-Gene sowie die Ad-Helfergene (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 und VA-RNA) in einem Plasmid (pHelper) enthalten sind, einige praktische Vorteile gegenüber der üblichen Drei-Plasmid-(Dreifach-) Transfektionsmethode, einschließlich reduzierter Kosten für die Plasmidproduktion^23,24 . Das AAV-Genomplasmid, das die Transgenexpressionskassette (pTransgene) enthält, muss von ITRs flankiert werden und darf eine Länge von ~4,7 kb nicht überschreiten. Vektortiter und Reinheit können durch das Transgen aufgrund möglicher zytotoxischer Wirkungen während der Transfektion beeinflusst werden. Die Beurteilung der Vektorreinheit wird hierin beschrieben. Mit dieser Methode hergestellte Vektoren, die jeweils 1 x^{10 13} vg/ml ergeben, wurden in Mäusen, Hamstern und Schafmodellen bewertet.

Tabelle 1: Zusammensetzung der erforderlichen Lösungen. Notwendige Informationen, einschließlich Prozentsätze und Volumen, von Komponenten, die für verschiedene Lösungen im gesamten Protokoll benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.