在细胞堆中生产腺相关病毒载体，用于大型动物模型的临床前研究

利用腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗在过去三十年中取得了巨大的进步^1，2。在各种遗传疾病（包括先天性失明，血友病以及肌肉骨骼和中枢神经系统疾病）中表现出的改善，使AAV基因治疗成为临床研究的前沿^3，4。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准了Glybera，一种表达脂蛋白脂肪酶（LPL）的AAV1载体，用于治疗LPL缺乏症，使其成为欧洲或美国基因治疗的首个上市授权⁵。从那时起，另外两种AAV基因疗法Luxturna⁶和Zolgensma⁷已获得FDA批准，预计到2025年，市场将迅速扩大，预计到2025年将有多达10-20种基因疗法^8。现有的临床数据表明，AAV基因治疗是一种安全、耐受性良好且有效的方法，使其成为最有前途的病毒载体之一，超过244项涉及AAV的临床试验已 ClinicalTrials.gov 注册。对涉及AAV载体的临床应用的兴趣日益增加，需要强大且可扩展的生产方法来促进大型动物模型中AAV疗法的评估，因为这是转化管道中的关键步骤⁹。

对于AAV载体生产，两个主要要求是AAV基因组和衣壳。野生型（wt）-AAV的基因组是单链DNA，长度约为4.7 kb¹⁰。wt-AAV基因组包括在基因组两端发现的倒置末端重复序列（ITR），这对包装很重要，并且rep和cap基因^11。基因组复制，病毒衣壳组装以及将基因组封装到病毒衣壳中所必需的rep和cap基因从病毒基因组中移除并以反式形式提供用于AAV载体生产^12。从病毒基因组中去除这些基因为治疗性转基因和所有必要的调节元件（包括启动子和polyA信号）提供了空间。ITR保留在载体基因组中，以确保适当的基因组复制和病毒封装^13，14。为了改善转基因表达的动力学，可以将AAV载体基因组设计为自互补，这减轻了AAV基因组复制期间从单链DNA转换到双链DNA转换的需求，但将编码能力降低到〜2.4 kb^15。

除了AAV基因组设计之外，衣壳血清型选择还决定了体内AAV载体²的组织和细胞向性。除了组织向性外，不同的AAV血清型已被证明可以显示不同的基因表达动力学^16。例如，Zincarelli等人¹⁷将不同的AAV血清型分为低表达血清型（AAV2，3，4，5），中等表达血清型（AAV1，6，8）和高表达血清型（AAV7和9）。他们还将AAV血清型分为慢发表达（AAV2，3，4，5）或快速发作表达（AAV1，6，7，8和9）。这些不同的趋向性和基因表达动力学是由于衣壳蛋白中的氨基酸变异，衣壳蛋白的形成以及与宿主细胞受体/共受体的相互作用^18。一些AAV衣壳具有额外的有益特征，例如在血管内给药（AAV9）后穿过血脑屏障的能力或驻留在长寿的肌肉细胞中以持久转基因表达（AAV6，6.2FF，8和^{9）19，20。}

本文旨在详细介绍一种生产高纯度、高滴度、研究级AAV载体的具有成本效益的方法，用于临床前大型动物模型。使用该协议生产AAV是使用双质粒转染到在细胞堆叠中生长的贴壁人胚胎肾（HEK）293细胞来实现的。此外，该研究描述了硫酸肝素亲和色谱纯化的方案，可用于含有肝素结合结构域的AAV血清型，包括AAV2，3，6，6.2FF，13和DJ^21，22。

许多包装系统可用于生产AAV载体。其中，使用双质粒共转染系统，其中Rep和Cap基因以及Ad辅助基因（E1A，E1B55K，E2A，E4orf6和VA RNA）包含在一个质粒（pHelper）中，与常见的三质粒（三重）转染方法相比具有一些实际优势，包括降低质粒生产成本^23，24.含有转基因表达盒（pTransgene）的AAV基因组质粒必须由ITR两侧放置，并且长度不得超过约4.7 kb。由于转染过程中潜在的细胞毒性作用，载体滴度和纯度可能受到转基因的影响。本文描述了载体纯度的评估。在小鼠，仓鼠和绵羊动物模型中评估使用该方法生产的载体，每个载体产生1 x^{10 13} vg / mL。

表1：所需溶液的组成。整个协议中各种解决方案所需组件的必要信息，包括百分比和体积。 请点击此处下载此表格。