Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux
Summary
Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement >1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.
Abstract
Les vecteurs du virus adéno-associé (AAV) sont parmi les vecteurs de thérapie génique les plus avancés sur le plan clinique, avec trois thérapies géniques AAV approuvées pour les humains. L’avancement clinique de nouvelles applications pour l’AAV implique la transition de modèles de petits animaux, tels que des souris, à des modèles animaux plus grands, y compris des chiens, des moutons et des primates non humains. L’une des limites de l’administration d’AAV à des animaux plus gros est la nécessité de grandes quantités de virus à titre élevé. Bien que la culture cellulaire en suspension soit une méthode évolutive pour la production de vecteurs AAV, peu de laboratoires de recherche ont l’équipement (par exemple, les bioréacteurs) ou savent comment produire de l’AAV de cette manière. De plus, les titres AAV sont souvent significativement plus faibles lorsqu’ils sont produits dans des cellules HEK 293 en suspension par rapport aux cellules HEK293 adhérentes. Décrit ici est une méthode pour produire de grandes quantités d’AAV à titre élevé à l’aide de piles de cellules. Un protocole détaillé pour le titrage de l’AAV ainsi que des méthodes de validation de la pureté des vecteurs sont également décrits. Enfin, les résultats représentatifs de l’expression du transgène médiée par l’AAV dans un modèle ovin sont présentés. Ce protocole optimisé pour la production à grande échelle de vecteurs AAV dans les cellules adhérentes permettra aux laboratoires de biologie moléculaire de faire progresser les tests de leurs nouvelles thérapies AAV dans des modèles animaux plus grands.
Introduction
La thérapie génique utilisant des vecteurs de virus adéno-associés (AAV) a fait d’énormes progrès au cours des trois dernières décennies1,2. Les améliorations démontrées dans un large éventail de maladies génétiques, y compris la cécité congénitale, l’hémophilie et les maladies du système musculo-squelettique et du système nerveux central, ont amené la thérapie génique AAV à l’avant-garde de la recherche clinique3,4. En 2012, l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé Glybera, un vecteur AAV1 exprimant la lipoprotéine lipase (LPL) pour le traitement du déficit en LL, ce qui en fait la première autorisation de mise sur le marché pour un traitement de thérapie génique en Europe ou aux États-Unis5. Depuis lors, deux autres thérapies géniques AAV, Luxturna6 et Zolgensma7,ont reçu l’approbation de la FDA, et le marché devrait se développer rapidement au cours des 5 prochaines années avec jusqu’à 10-20 thérapies géniques attendues d’ici 20258. Les données cliniques disponibles indiquent que la thérapie génique AAV est une modalité sûre, bien tolérée et efficace, ce qui en fait l’un des vecteurs viraux les plus prometteurs, avec plus de 244 essais cliniques impliquant AAV enregistrés auprès de ClinicalTrials.gov. L’intérêt croissant pour les applications cliniques impliquant des vecteurs AAV nécessite des méthodes de production robustes et évolutives pour faciliter l’évaluation des thérapies AAV dans de grands modèles animaux, car il s’agit d’une étape critique dans le pipeline translationnel9.
Pour la production de vecteurs AAV, les deux principales exigences sont le génome AAV et la capside. Le génome de l’AAV de type sauvage (wt)-AAV est de l’ADN simple brin d’environ 4,7 kb de longueur10. Le génome wt-AAV comprend des répétitions terminales inversées (ITR) trouvées aux deux extrémités du génome, qui sont importantes pour l’emballage, et les gènes rep et cap 11. Les gènes rep et cap, nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside virale et à l’encapsulation du génome dans la capside virale, sont retirés du génome viral et fournis en trans pour la production de vecteurs AAV12. Le retrait de ces gènes du génome viral laisse place à des transgènes thérapeutiques et à tous les éléments régulateurs nécessaires, y compris le promoteur et le signal polyA. Les RTI restent dans le génome du vecteur pour assurer une réplication correcte du génome et une encapsulation virale13,14. Pour améliorer la cinétique de l’expression transgénique, les génomes des vecteurs AAV peuvent être conçus pour être auto-complémentaires, ce qui atténue le besoin de conversion de la conversion de l’ADN simple brin en double brin pendant la réplication du génome AAV, mais réduit la capacité de codage à ~ 2,4 kb15.
Au-delà de la conception du génome AAV, la sélection du sérotype de capside détermine le tropisme tissulaire et cellulaire du vecteur AAV in vivo2. En plus du tropisme tissulaire, il a été démontré que différents sérotypes AAV présentent une cinétique d’expression génique différente16. Par exemple, Zincarelli et coll.17 ont classé différents sérotypes AAV en sérotypes à faible expression (AAV2, 3, 4, 5), sérotypes à expression modérée (AAV1, 6, 8) et sérotypes à expression élevée (AAV7 et 9). Ils ont également classé les sérotypes AAV en expression lente (AAV2, 3, 4, 5) ou expression à apparition rapide (AAV1, 6, 7, 8 et 9). Ces tropismes divergents et la cinétique d’expression des gènes sont dus aux variations des acides aminés dans les protéines de la capside, aux formations de protéines de la capside et aux interactions avec les récepteurs/corécepteurs de la cellule hôte18. Certaines capsides AAV ont des caractéristiques bénéfiques supplémentaires telles que la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique après administration intravasculaire (AAV9) ou résident dans des cellules musculaires à longue durée de vie pour une expression transgénique durable (AAV6, 6.2FF, 8 et9) 19,20.
Cet article vise à détailler une méthode rentable pour produire des vecteurs AAV de haute pureté, à haut titre et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. La production d’AAV à l’aide de ce protocole est réalisée par transfection à double plasmide dans des cellules adhérentes du rein embryonnaire humain (HEK)293 cultivées dans des piles cellulaires. En outre, l’étude décrit un protocole pour la purification par chromatographie d’affinité du sulfate d’héparine, qui peut être utilisé pour les sérotypes AAV qui contiennent des domaines de liaison à l’héparine, y compris AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 et DJ21,22.
Un certain nombre de systèmes d’emballage sont disponibles pour la production de vecteurs AAV. Parmi ceux-ci, l’utilisation d’un système de co-transfection à deux plasmides, dans lequel les gènes Rep et Cap et les gènes auxiliaires Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 et ARN VA) sont contenus dans un plasmide (pHelper), présente certains avantages pratiques par rapport à la méthode de transfection commune à trois plasmides (triple), y compris un coût réduit pour la production de plasmides23,24 . Le plasmide du génome AAV contenant la cassette d’expression du transgène (pTransgene) doit être flanqué de RTI et ne doit pas dépasser ~4,7 kb de longueur. Le titre et la pureté des vecteurs peuvent être affectés par le transgène en raison des effets cytotoxiques potentiels pendant la transfection. L’évaluation de la pureté du vecteur est décrite ici. Les vecteurs produits à l’aide de cette méthode, qui donnent un 1 x10 13 vg/mL pour chacun, ont été évalués chez des souris, des hamsters et des modèles animaux ovins.
Tableau 1 : Composition des solutions requises. Informations nécessaires, y compris les pourcentages et les volumes, des composants nécessaires pour diverses solutions tout au long du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Protocol
Representative Results
Discussion
La production de vecteurs AAV recombinants (rAAV) décrits dans cet article utilise des matériaux, des réactifs et de l’équipement courants trouvés dans la majorité des laboratoires et des installations de recherche en biologie moléculaire. Cet article permet au lecteur de produire des rAAV in vitro et in vivo de haute qualité. Surtout, ce protocole de production de rAAV, par rapport à des protocoles plus fastidieux impliquant la purification du chlorure de césium, est efficace et évite l’…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas et Jacob G. E. Yates ont reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario Veterinary College ainsi que des bourses d’études supérieures de l’Ontario. Amira D. Rghei a reçu une bourse d’études Mitacs Accelerate. Ces travaux ont été financés par la subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (no 66009) et une subvention de projets de recherche en santé concertée (partenariat avec le CRSNG) (no 433339) à SKW.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
Referencias
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020)
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020)
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020)
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -. A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- . Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996)
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
