Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) est une plate-forme robuste pour le criblage d’expression et la production des méthyltransférases d’arginine de protéine (PRMTs) à utiliser pour des études biochimiques, biophysiques et structurelles. Des quantités milligrammes de matière peuvent être produites pour la majorité des PRT et d’autres protéines d’intérêt nécessitant une plate-forme d’expression eucaryote.
Protéine arginine méthyltransférases (PRMTs) résidus de méthylate arginine sur une grande variété de protéines qui jouent des rôles dans de nombreux processus cellulaires. PrmTs peut mono- ou diméthylate arginine groupes guanidino symétriquement ou asymétriquement. L’enzymologie de ces protéines est un domaine complexe et intensément étudié qui nécessite des quantités de milligrammes de protéines recombinantes de haute qualité. Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) utilisant des cellules d’insectes à nucléopolyédrovirus multiple d’Autographa californica (AcMNPV) et de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) a été utilisé pour le dépistage de l’expression et la production de nombreux PRMT, y compris prmt 1, 2 et 4 à 9. Pour dépister simultanément l’expression de plusieurs constructions de ces protéines, y compris les domaines et les fragments tronqués ainsi que les protéines pleine longueur, nous avons appliqué des méthodes évolutives en utilisant des pipettes multicanaux réglables et programmables, combinées à des plaques et des blocs de 24 et 96 puits. Dans l’ensemble, ces ajustements de méthode ont permis une génération à grande échelle d’ADN bacmid, de virus recombinants et de criblage de l’expression des protéines. L’utilisation de récipients de culture avec un volume de remplissage élevé de suspension cellulaire Sf9 a aidé à surmonter les limitations d’espace dans le pipeline de production pour la production de protéines à grande échelle en lot unique. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’expression efficace et rentable des PRMTs fonctionnels pour des études biochimiques, biophysiques, et structurales.
Résidus de méthyltransférases d’arginine de protéine d’arginine d’arginine symétrique ou symétrique/asymétrique. Les séquences répétitives RG/RGG/GRG sont fortement préférées par la plupart des PRMTs et se retrouvent dans une grande variété de protéines1,2. Les protéines méthylées par l’arginine telles que les histones ou les facteurs de transcription et les facteurs d’épissage régulent la transcription, l’épissage et la structure de la chromatine3,4. La connaissance croissante de la régulation diverse de l’utilisation du substrat et des cofacteurs, du chiffre d’affaires et de la cinétique des PRMTs, ainsi que la génération d’inhibiteurs sélectifs, ont apporté une lumière mécaniste sur ces enzymes et leurs complexes5,6. Cependant, tous les membres de la famille prmt ne sont pas étudiés dans la même mesure; par exemple, PRMT9 n’a été découvert que récemment comme appartenant à la famille PRMT1. Les études de structure et de fonction enzymatique de ces protéines nécessitent des quantités suffisantes, souvent en milligramme, de protéines recombinantes pour être disponibles.
Le système d’expression procaryote Escherichia coli (E. coli)est généralement le premier choix pour le criblage d’expression utilisant de multiples constructions pour une protéine donnée7,8,9. Cependant, l’expressionà base de E. coli n’entraîne pas toujours des quantités suffisantes de protéines PRMT sous leurs formes actives, comme nous l’avons noté en particulier pour PRMT5 et PRMT7 (voir ci-dessous). Ainsi, les PRMF qui ne se sont pas exprimé dans E. coli ou qui devaient être produites par la machinerie d’expression eucaryote ont été subclonées en vecteurs appropriés pour le criblage de l’expression dans le système vectoriel d’expression alternative du baculovirus (BEVS). Alors que les échantillons de PRMT1, PRMT3 et PRMT8 exprimés par E. coli ont été largement utilisés pour des essais in vitro et la cristallographie, d’autres PRMT tels que PRMT5, qui nécessite un partenaire de liaison MEP50 de son double domaine de méthyltransférase, et des PRMTts tels que PRMT7 et 9, nécessitent l’expression de cellules d’insectes pour obtenir des quantités suffisantes de protéines actives. Dans l’ensemble, les tests normalisés de méthyltransférase à moyen débit pour PRMT4, 5, 6, 7 et 9 ont utilisé le BEVS dans les cellules d’insectes6. Le système vectoriel d’expression des baculovirus (BEVS) est une plateforme polyvalente pour produire des protéines recombinantes nécessitant la machinerie d’expression eucaryote qui permet des modifications post-traductionnelles essentielles pour les études biochimiques, biophysiques et structurelles10,11,12. Plusieurs BEVS sont devenus disponibles dans le commerce depuis la première utilisation signalée de baculovirus en 1983 pour l’expression des protéines13. La plupart de ces protocoles emploient différentes stratégies pour le transfert du plasmide d’expression dans les cellules d’insectes. Ceux-ci incluent Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Notre protocole est basé sur le système le plus couramment utilisé dans le BEVS, le système Bac-to-Bac14,qui est conçu pour transférer le gène/ADNc codant pour la protéine d’intérêt (POI, ici les PRMT) dans le génome du baculovirus maintenu dans une souche spécialisée de E. coli via une transposition spécifique au site15.
En bref, le vecteur de transfert de plasmide contenant le gène d’intérêt a été transformé en cellules compétentes DH10Bac E. coli pour générer de l’ADN bacmid viral recombinant. Les cellules Sf9 adhérentes ont ensuite été transfectées avec de l’ADN bacmid. Quatre à cinq jours après transfection, des baculovirus de recombinaison initiaux sécrétés dans le milieu de culture cellulaire ont été récupérés et marqués comme virus P1. Les stocks de baculovirus P1 ont ensuite été utilisés pour l’amplification du virus (c.-à-d. la génération de stocks de baculovirus P2) et le dépistage de l’expression des protéines. Sur la base des résultats du criblage de l’expression, les virus P2 pour la meilleure construction d’expression de la protéine ont été identifiés et utilisés pour générer des cultures en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus (SCBIIS) pour la production de protéines à grande échelle. Ici, nous décrivons nos protocoles détaillés et décrivons la raison d’être de nos choix de réactifs et de récipients de culture pour soutenir notre stratégie de développement d’une méthodologie plus rapide, rentable et évolutive pour obtenir des quantités suffisantes de protéines recombinantes souhaitées.
L’un des avantages du BEVS dans les cellules d’insectes se concentre sur la capacité de la machinerie de modification post-traductionnelle à permettre des modifications plus complexes telles que la phosphorylation, la myristoylation et la glycosylation. Associées au repliement très efficace des protéines de mammifères, ces modifications facilitent de grandes quantités de protéines modifiées et repliées adaptées aux expériences en aval physiologiquement pertinentes16.
Ici, nous avons décrit les protocoles détaillés du BEVS mettant l’accent sur les éléments critiques pour le criblage réussi de l’expression de multiples constructions de protéines PRMT et la production à grande échelle de protéines PRMT dans la plate-forme d’expression de Baculovirus: 1) L’utilisation de pipettes multicanaux régulières, réglables et programmables pour transférer les matériaux biologiques entre 24 et 96 – plaques et blocs de culture cellulaire de puits aux stades de la génération d’ADN bacmid et de virus; une collection des virus recombinants, une amplification des volumes viraux des virus recombinants et la préparation des blocs de criblage de l’expression protéique. 2) Réactifs de transfection haute performance et rentables pour la génération de virus recombinants. 3) Culture en suspension de cellules d’insectes infectées par le baculovirus (SCBIIC) pour la production de protéines à grande échelle. 4) Utilisation de fioles de secouage Fernbach à volume élevé de 2,8 L pour maintenir la culture en suspension sf9 et de flacons de secouer Tunair de 2,5 L et de bouteilles de réactifs de 5 L pour la production de protéines à grande échelle.
Considérations spéciales et justification des étapes de transformation et de transfection.
Bien qu’un protocole commercial recommande d’utiliser 100 μL de cellules compétentes pour une transformation14,l’efficacité de transformation des cellules commerciales compétentes en DH10Bac E. coli est aussi élevée que 1 x 108 ufc / μg d’ADN, nous n’utilisons donc que 4 μL. Ceci est suffisant pour que chaque transformant obtienne des colonies recombinantes blanches isolées pour l’isolement de l’ADN bacmid. Les cellules Sf9 adhérentes dans la plaque de transfection de 24 puits ont été ensemencées à une densité cellulaire de 2 x10 5 /mL dans 0,5 mL de milieux d’insectes sans sérum. Ce volume est suffisant pour assurer une couverture uniforme de la surface de travail du puits. Dans le même temps, il ne dilue pas trop le mélange de transfection, ce qui améliore l’efficacité de la transfection. Les réactifs de transfection ne sont pas toxiques pour les cellules Sf9, et l’échange de médias n’est pas nécessaire. Au lieu d’un changement de support, un support supplémentaire de 1,5 mL contenant 10% (v / v) FBS est ajouté dans la plaque de transfection à 4-5 heures après le temps de transfection pour faciliter la croissance cellulaire. L’efficacité de transfection des deux réactifs de transfection est élevée. Pourtant, avec X-tremeGene 9, les signes d’infection dans les cellules transfectées (Figure 2) apparaissent 10-12 h plus tôt qu’avec le réactif JetPrime, nous choisissons donc entre ces réactifs en fonction du calendrier de travail des prochaines étapes des protocoles, ce qui offre une certaine flexibilité dans le processus global.
Le criblage d’expression de test de protéine peut être mis en place avec des virus P2 si la quantité des virus recombinants initiaux, recueillis à partir de la plaque de transfection et étiquetés comme P1, est un facteur limitant à utiliser pour le criblage d’expression de protéine.
Considérations lors du passage de petits à grands volumes de culture.
Historiquement, on croyait que la croissance cellulaire optimale nécessite un espace d’air élevé dans la culture de suspension de la maintenance des cellules Sf9 et des productions à l’échelle. Cependant, en 2014, il a été signalé que l’espace en haute mer dans les navires de culture est moins critique qu’on ne le pensait auparavant17. Un récipient de culture installé à l’aide d’une vitesse de secousse ajustée de manière appropriée au jet orbital de la plate-forme de secousse fournira un transfert d’oxygène suffisant même dans la culture de suspension à volume de remplissage élevé en créant et en maintenant de petites bulles d’air pendant une période plus longue. Avec cette approche, les cellules d’insectes disponibles dans le commerce peuvent être cultivées à une vitesse de secousse plus élevée dans une plage normale du temps de doublement des cellules sans sacrifier la viabilité cellulaire élevée.
Ainsi, il y a 6 ans, nous avons commencé à augmenter le volume de culture en suspension dans une fiole secouée pendant l’entretien des cellules et avons introduit un type différent de récipient de culture pour la production de protéines tout en ajustant et en surveillant les conditions de secousse (Figure 6). Pour établir des conditions optimales dans ces vaisseaux de culture, nous avons surveillé les paramètres de culture cellulaire Sf9 tels que le temps de doublement cellulaire ainsi que la viabilité, la taille et la forme des cellules, l’état d’agrégation et l’infectiosité des cellules.
Par exemple, pour l’entretien des cellules Sf9, dans les flacons de shake de Fernbach de 2,8 L, nous cultures 2 L au lieu de 0,8 L des cellules de suspension Sf9 secouant à 150 tr / min à 27 ° C et la viabilité cellulaire est proche de 99%, avec des cellules de division saines de forme uniforme. Pour la production à grande échelle, nous infectons 4 L de cellules dans des bouteilles de réactifs de 5 L secouant à grande vitesse à 145 tr / min à une température abaissée de 25 ° C. Les incubateurs les plus couramment utilisés avec une plate-forme de secousse intégrée peuvent contenir des flacons de secouage de 6 x 2,8 L ou des bouteilles de réactif de 6 x 5 L, ou des flacons de secouage Tunair de 10 x 2,5 L. Ainsi, la capacité de la plate-forme de secousse unique, si nous remplissons les flacons de secouage Fernbach et les bouteilles de réactifs à 1/3 par rapport au volume de remplissage élevé des récipients est de 4,8 L contre 12 L en utilisant des flacons de secouer Fernbach de 2,8 L et de 10 L contre 24 L en utilisant des bouteilles de réactifs de 5 L(Figure 6). L’entretien de la culture cellulaire en suspension et la production à grande échelle dans les récipients de culture avec un volume de remplissage élevé nous ont aidés à surmonter les limites des volumes de production et à adopter une plate-forme à grande échelle. Ainsi, cela est très utile pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux bioréacteurs et/ou dont l’espace dans les pipelines de production est limité.
Ce protocole pourrait être facilement adapté à la production et à la purification de constructions protéiques avec différentes étiquettes d’affinité en utilisant des résines appropriées et en modifiant les tampons de purification comme cela a été décrit dans l’article6 publié par SGC pour les protéines pleine longueur marquées par drapeau de PRMT4, 7, 9, et le complexe PRMT5-MEP50 marqué par His et PRMT6. Bien que nous décrivions un protocole BEVS pour la famille prmt des protéines, la même approche peut être appliquée à n’importe quelle autre famille de protéine.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs souhaitent remercier Dalia Barsyte-Lovejoy d’avoir pris le temps de fournir des commentaires précieux et critiques sur le manuscrit et tous nos collègues de la CGT qui ont travaillé avec la famille de protéines PRMT exprimées à partir du système vectoriel d’expression du baculovirus.
Le CGS est un organisme de bienfaisance enregistré (numéro 1097737) qui reçoit des fonds d’AbbVie, bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Génome Canada par l’entremise de l’Institut de génomique de l’Ontario [OGI-196], de l’UE et de l’EFPIA par l’entremise de l’entreprise conjointe Innovative Medicines Initiative 2 [subvention EUbOPEN 875510], de Janssen, de Merck KGaA (alias EMD au Canada et aux États-Unis), de Pfizer, de Takeda et du Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |