Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Nota : la descripción general de los pasos del protocolo BEVS se describe en la figura 1. 1. Generación de un ADN bacmid recombinante Preparación de placas selectivas de agar LB para la transformación DH10Bac Prepare placas de agar LB que contengan: 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 200 μg/mL de Bluo-gal y 40 μg/mL de IPTG para seleccionar los transformantes DH10Bac. Pesar 25 g de caldo LB premezclado y 13 g de agar Bacto y poner en matraz de 2 L. Lleve el volumen a 1 L con agua destilada y autoclave durante 15-30 min a 121 °C. Establezca un baño de agua a 50 °C y enfríe la solución de agar autoclave en el baño de agua durante 40-60 minutos hasta que se enfríe a 50-55 °C. A la solución enfriada, añadir gentamicina a una concentración final de 7 μg/mL, kanamicina a una concentración final de 50 μg/mL, tetraciclina a una concentración final de 10 μg/mL, Bluo-gal a una concentración final de 200 μg/mL e IPTG a una concentración final de 40 μg/mL. Mezcle la solución de agar y alícuota 7-10 mL del medio a cada placa de 60 mm utilizando una pipeta de 50 mL. Deje que las placas se sientan a temperatura ambiente (2 h) para endurecerse. Invertir, envolver y almacenar a 4 °C. Las placas que contienen antibióticos son estables hasta por 4 semanas. Transformación del plásmido en células competentes de DH10Bac E. coli Calcular el volumen requerido de celdas competentes. Descongele las células competentes en el hielo, gire suavemente hacia abajo y resuspend hacia atrás mediante un suave golpeteo. Utilice una pipeta de 12 canales para dispensar 4 μL de las células en cada pozo de la placa de PCR de 96 pozos. Añadir ~ 0.3-0.5 μg de ADN plásmido recombinante a las células competentes y mezclar suavemente tocando. Incubar la mezcla sobre hielo durante 10-15 min. Choque térmico de la mezcla en una máquina de PCR a 42 °C durante 45 s. Enfríe sobre hielo durante 2 min. Dispense 0.5 mL de medio SOC a cada pozo de los bloques de 96 pozos (pozo de 96 profundidades 2.4 mL). Utilice una pipeta de 12 canales para transferir la suspensión bacteriana transformada al pozo correspondiente del bloque y cubrirlo con una lámina de airpore. Colocar el bloque en una incubadora de agitación a 37 °C con agitación media (205 rpm) durante 4-5 h. Extienda uniformemente 30-50 μL del cultivo sobre la superficie de la placa de agar LB utilizando perlas de vidrio estériles. Almacene el resto del cultivo a 4 °C. Incubar las placas a 37 °C hasta que el color de las colonias azul/blancas sea discernible (40-48 h). Deseche el cultivo cuando se obtengan suficientes colonias grandes y blancas en el plato. Para asegurarse de que las colonias blancas contienen solamente la DNA recombinante del bacmid, re-rayar una colonia blanca aislada sobre las placas frescas del agar de la libra que contienen los antibióticos, el bluo-gal, y iptg para verificar el fenotipo. Incubar durante 48 h a 37 °C. Elija una colonia blanca verificada de una placa re-rayada para la extracción de ADN bacmid recombinante. Aislar el ADN bacmid recombinante Inocular una sola colonia blanca aislada en 3 mL de medio LB suplementado con kanamicina de 50 μg/mL, 7 μg/mL de gentamicina y 10 μg/mL de tetraciclina en bloques de 24 pozos (bloques de 24 pozos de fondo redondo) y cubrir con una lámina de airporo. Crecer a 37 °C durante la noche con temblores a 250 rpm. Centrifugar los bloques de 24 pozos a 2.100 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante, invertir el bloque y tocar suavemente un papel de seda absorbente. Añadir 250 μL de solución 1 (solución de resuspensión celular) a cada pozo. Selle los bloques con almohadillas de cinta o cualquier otra película de sellado y colótelos en una plataforma de agitación a 75 rpm durante 5-10 min. Revise cada pozo para asegurar la lisis celular adecuada, y resuspend si es necesario, utilizando una punta de 1 mL. Añadir 250 μL de solución 2 (solución de lisis celular) a cada pozo, sellar los bloques y colocarlos en una plataforma de agitación a 75 rpm durante 30 s (para evitar la contaminación cruzada de las muestras, no invertir bloques de 24 pozos) incubando a temperatura ambiente durante 4 min. Añadir 250 μL de solución 3 (solución de neutralización), sellar los bloques y colocarlos sobre la plataforma de agitación a 75 rpm durante 30 s. Se formará un precipitado blanco espeso de proteína y ADN genómico de E. coli. Coloque la muestra sobre hielo durante 10-15 min. Centrífuga durante 60 min a 2.100 x g a 4 °C para peletizar firmemente el material de precipitado blanco. Durante la centrifugación, etiquete un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 0,8 mL de isopropanol absoluto. Transfiera suavemente el sobrenadante al tubo que contiene isopropanol, evitando cualquier material de precipitado blanco. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo unas cuantas veces y luego colocar sobre hielo durante 5 a 10 min. En esta etapa, la muestra se puede almacenar a -20 °C durante la noche. Centrifugar la muestra durante 15 min a 14.000 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 0.5 mL de etanol al 70% a cada tubo. Invierta el tubo varias veces para lavar el pellet. Centrífuga durante 5 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. (Opcional: repetir lavado) Traiga muestras dentro de la campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de la preparación del plásmido y elimine la mayor cantidad posible del sobrenadante.NOTA: El pellet puede desalojarse de la parte inferior del tubo, así que observe cuidadosamente el pellet al descartar el sobrenadante. Seque al aire el pellet dentro de la campana de flujo laminar durante 15 – 20 min y disuelva el ADN en 50 μL de tampón de elución filtrada, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (asegúrese de que los pellets no estén sobresecados). Dado que el ADN de bacmid recombinante es mayor de 135 kb de tamaño, para evitar la cizalladura del ADN, disuelva el pellet mediante un suave golpeteo. Para verificar la presencia del gen de interés en el ADN bacmid, configure la mezcla de reacción de PCR en una placa de PCR de 96 pozos. Prepare la mezcla de PCR de la siguiente manera: 1 μL de tampón, 0,2 μL (10 mM cada uno) de dNTPs, 0,1 μL de ADN polimerasa Taq, 0,1 μL (25 μM) de cebadores delanteros e inversos (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL de ADN bacmid y 8 μL de agua. Realizar la amplificación de los genes diana con desnaturalización inicial durante 2 min a 95 °C, seguido de 25 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min/kb. Terminar la reacción después de una extensión final durante 7 min a 72 °C. Analizar 10 μL del producto de amplificación en gel de agarosa al 1% (p/v) que contiene solución de tinción de ácido nucleico por electroforesis. Almacene los DNAs de bacmid verificados a 4 °C. 2. Generación de reservas de baculovirus recombinantes NOTA: Utilice células Sf9 de crecimiento exponencial con una viabilidad del 95% o mayor para cualquier paso del protocolo de expresión de baculovirus, incluida la transfección celular para la generación de baculovirus, la amplificación del volumen de baculovirus, la detección de expresión de proteínas y la producción de proteínas. Transfección de células Sf9 con ADN Bacmid y reactivos de transfección (T.R.) como JetPrime o X-tremeGENE 9.NOTA: La tinción de Trypan Blue y un hemocitómetro se pueden utilizar para determinar recuentos celulares viables y % de viabilidad celular. Las células no viables toman la mancha y aparecen azules bajo el microscopio, mientras que las células viables permanecen sin manchar. Para calcular el % de viabilidad celular, se obtiene un recuento total de células (no manchado y teñido) y el recuento de células viable se divide por el recuento total de células y se multiplica por 100. Diluya las células Sf9 de crecimiento exponencial a una densidad celular final de 4 x 105 células/mL en medios de insectos sin suero y vierta en el reservorio de reactivos estériles. Utilice una pipeta multicanal programable para sembrar 0,5 mL de las células Sf9 diluidas en cada pozo de una placa de 24 pozos. Etiquete un pozo de la placa como un control (no transfectado) y utilícelo como control para comparar las células transfectadas y no transfectadas para evaluar posibles signos de infecciones. Después de sembrar las células en las placas, mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces para asegurar una monocapa uniforme de células. No gire las placas porque las células se agruparán en el centro del pozo. Incubar las placas a 27 °C durante al menos 1 h para permitir la fijación celular a las placas de cultivo. Mezcle bien el vial del reactivo de transfección. Para cada transfección, añadir 2 μL del reactivo de transfección a 100 μL del tampón de transfección. También se puede utilizar cualquier otro medio de insectos no suplementado. Deposite el reactivo de transfección diluido en un depósito de reactivo estéril y mezcle suavemente durante 10 s. Usando una pipeta de 12 canales, transfiera 102 μL del reactivo de transfección diluido a una placa estéril de 96 micropcillos. Transfiera 10 μL de una solución de 0,2 μg/μL de ADN de bacmid recombinante en el pozo correspondiente de una placa de micropcillos de 96 pozos y mezcle agitando suavemente (tocando) la placa desde los lados. Incubar la mezcla de transfección durante 15-20 min para permitir la formación compleja. Utilizando una pipeta ajustable de 6 canales diseñada para la transferencia entre placas de 96 y 24 pozos, agregue la mezcla de transfección a las células gota a gota en los pozos correspondientes de las placas de transfección e incube durante 4-5 h a 27 °C. Mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces durante el tiempo de incubación para asegurar la distribución uniforme de la mezcla de transfección sobre la monocapa celular. 4-5 h después de la transfección, añadir 1,5 mL de medio libre de suero de insectos suplementado con un 10% (v/v) final de suero bovino fetal inactivado por calor y antibiótico-antimicótico al 1% (v/v) de volumen final (100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 0,25 μg/mL de anfotericina B). Incubar las células en una incubadora de 27 °C durante 72-96 h. Mezcle suavemente las placas de transfección una vez al día cuando sea posible. Busque signos de infección (SOI), evidentes en las células transfectadas a las 72-96 h después de la transfección(Figura 2). Tenga en cuenta que las células transfectadas comenzarán a producir el virus e infectarán aún más el cultivo; por lo tanto, busque los signos de infección.NOTA: Los signos de infección son cambios estructurales en las células de los insectos, como un aumento del 25-50% en el diámetro celular, núcleos celulares agrandados, forma uniformemente redondeada, pérdida de proliferación y adherencia a la superficie del plato de cultivo, así como una disminución en la viabilidad celular(Figura 2. Baculovirus Células Sf9 infectadas y no infectadas). 3. Cribado de expresión de proteínas a pequeña escala y amplificación de virus Infección de las células Sf9 con las acciones del baculovirus P1.NOTA: 4-5 días después de la transfección, los signos de infección deben ser evidentes en las células transfectadas en comparación con las células de control (no transfectadas) bajo un microscopio invertido. Los baculovirus recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular deben estar listos para recolectarse. Semilla 2 x 105 células Sf9 de crecimiento exponencial en medios de insectos sin suero en cada pozo de las placas de 24 pozos en un volumen total de 2 mL para la infección con virus P1 para amplificar el volumen del virus (lo que resulta en la generación de los virus P2). Después de pipetear las células en las placas, mezcle suavemente las placas, usando movimiento de ida y vuelta para asegurar una monocapa uniforme. No gire las placas porque las células se agruparán en el centro del pozo. Incubar las placas a 27 °C durante al menos 1 h para permitir la adherencia celular a la placa. Dispense 4 mL de células Sf9 a una densidad de 3.5-4 x 106 en medio libre de suero de insectos en cada pozo de bloques de 24 pozos para infectar con virus P1 para el cribado de expresión de proteínas.NOTA: Etiquete un pozo de las placas de 24 y los bloques de 24 pozos como control y utilícese como un control no infectado para la comparación de células infectadas y no infectadas cuando busque SOI. Utilizar una multicanal electrónica programable para permitir la recogida simultánea de virus P1 (paso 2.1.13), la infección de células Sf9 recién sembradas (paso 3.1.1) y la infección de las células suspensiones en los bloques de 24 pozos (paso 3.1.4) con 150 μL de virus P1. Gire hacia abajo el resto de las existencias virales P1 recogidas durante 15 minutos a 17.970 x g,transfiéndolas a tubos de microcentrífuga y guárdelas en la oscuridad a 4 °C. Mezcle suavemente las placas de 24 pozos (paso 3.1.1) en una coctelera recíproca para asegurar una distribución uniforme de los virus P1 añadidos sobre la monocapa celular; repita esto unas cuantas veces durante el tiempo de incubación. Cubra los bloques de 24 pozos con el cultivo en suspensión de células Sf9 infectadas (paso 3.1.4) con una lámina de aire. Incubar los bloques de 24 pozos a 27 °C, temblando a 245 rpm durante 72-96 h. Busque SOI dentro de 72-96 h después del tiempo de infección en las placas de 24 pozos con virus P2 (paso 3.1.1) y en los bloques de 24 pozos (paso 3.1.4) con células infectadas para el cribado de expresión.NOTA: 4-5 días después de la infección de las células Sf9 con los virus P1, SOI debe ser evidente en las células infectadas cuando está comparado a las células no infectadas del control bajo un microscopio invertido. Recoger los virus P2 de placas de 24 pozos, centrífuga durante 15 min a 17.970 x g,transferirlos a tubos de microcentrífuga y almacenar en la oscuridad a 4 °C. A las 72-96 h después de la infección, rocíe sobre los bloques de 24 pozos con etanol al 70%, lleve a la campana de flujo laminar y verifique la densidad celular y la viabilidad en algunos pozos mediante la tinción trypan blue. Proceder a la purificación de proteínas si las células tienen signos de infección y la viabilidad es cercana al 70-75% según lo evaluado por trypan azul tinción. Peletizar las células centrifugando los bloques de 24 pozos a 525 x g a 4 °C durante 15 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender completamente los pellets en 1 mL de tampón de lisis que comprende 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% de glicerol (v/v) y 1x cóctel inhibidor de la proteasa (100x cóctel inhibidor de proteasa comprende aprotinina 0,25 mg/mL, leupeptina 0,25 mg/mL, pepstatina A 0,25 mg/mL; E-64 0,25 mg/mL). Conservar la suspensión celular a -80 °C para la purificación de ensayo posterior (véase 3.2.2). Purificación de proteínas de la suspensión de células congeladas en bloques de expresión de prueba de 24 pozos. Montaje del bloque de enlace (Figura 3). Coloque 3 capas superpuestas de parafilm en la parte superior del bloque de pozos de 96 profundidades (pozo de 96 profundidades de 2,4 mL). Coloque una placa de filtro de 96 pocillos (microplaca de filtro, 96 pocillos, polipropileno con membrana de polietileno de ultra alto peso molecular de 25 μm) en la parte superior del bloque de pozos de 96 pulgadas. Empuje hacia abajo la placa de filtro para asegurar las puntas en el parafilm para sellar la placa de filtro del bloque de 96 pozos de profundidad. Transfiera 50 μL de purines de resina de Ni-NTA preequilibrados al 50% en cada pozo de la placa de filtro. Procedimiento de expresión de prueba Colocar la suspensión de celda congelada (paso 3.1.15) presente en bloques de 24 pozos en un baño de agua en RT durante 5-10 min, luego agitar a 450 rpm durante 20 min. Centrifugar los bloques de 24 pozos a 3.275 x g durante 15 min. Utilizando una pipeta multicanal, transfiera los lisatos despejados a una placa de filtro que contenga 50 μL de lodo de resina de Ni-NTA al 50% preequilibrado (paso 3.2.1.4) y selle la placa de filtro con una estera de tapa de 96 pozos (estera de tapa de 96 pozos, para uso con pozo cuadrado, 2 mL).NOTA: Utilice algunas bandas elásticas para mantener el bloque de unión juntos durante los pasos de incubación y centrifugación. Coloque el bloque de unión asegurado durante 45-60 minutos en un rotador en una cámara frigorífica para incubar los lisatos despejados con resina de Ni-NTA. Después de la incubación, levante cuidadosamente la placa filtrante y retire la capa de parafilm de la superficie del bloque de pozos de 96 profundidades (paso 3.2.1.1). Coloque de nuevo la placa de filtro en la parte superior del bloque de pozo de 96 profundidades y gire hacia abajo el bloque de unión asegurado durante 2 minutos a 235 x g. Lave la resina de Enlace Ni-NTA 2x con 2 mL de tampón de lavado que comprende 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol y 15 mM de imidazol. Gire hacia abajo el bloque con tampón de lavado cada vez durante 5 minutos a 235 x g para asegurar la eliminación completa del líquido residual. Transfiera la placa de filtro en la parte superior de la placa de PCR de 96 pozos que contiene 10 μL de tinte de carga 4x. Añadir 40 μL de tampón de elución (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazol) a cada pozo de la placa filtrante e incubar durante 5 min. Gire hacia abajo el bloque para eluir las proteínas en la placa de PCR de 96 pozos a 235 x g durante 10 min. Selle la placa de PCR de 96 pozos con almohadilla de grifo resistente a altas temperaturas y caliente a 98 °C durante 3 min. Cargue 15 μL de muestras de proteínas elutidas en un tampón Laemmli estándar en gel SDS-PAGE al 4-20% junto a la escalera de proteínas y ejecute el gel con un tampón estándar que contenga SDS. Manche el gel con azul Coomassie y des-mancha con agua. Analice los resultados de la expresión de prueba para identificar las mejores construcciones de expresión para la producción a gran escala. 4. Preparaciones de las células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC) para la producción de proteínas 4 días antes del tiempo de producción programado, dividir exponencialmente el crecimiento exponencial de las células Sf9 a una densidad celular final de 2 x10 6 células / mL en 125 mL / 250 mL / 500 ml de frascos de agitación de vidrio Erlenmeyer con deflectores en 50 mL / 100 mL / 200 mL de insectos sin suero que contiene 1% (v / v) antibiótico-antimicótico final. Añadir 0,150 mL/0,300 mL/0,6 mL de virus P2 apropiados, incubar células infectadas a 165 rpm en un agitador orbital con una carrera de una pulgada y a una temperatura más baja de 25 °C para ralentizar la división celular. A los 4 días después de la infección, compruebe las células bajo un microscopio para SOI y proceder a la producción si la viabilidad de la célula como se verificó con la tinción de Trypan Blue es cercana al 70-75%. 5. Preparaciones celulares sf9 para la producción de proteínas a gran escala 4 días antes del tiempo de producción programado, calcule el volumen requerido de células Sf9 para la producción de proteínas a gran escala. Semilla 2 L de células Sf9 de crecimiento exponencial en medio libre de suero de insectos a una densidad celular de 1 x 106 células /mL en frascos de agitación Fernbach de 2,8 L. Incubar los matraces a 27 °C con agitación fijada a 150 rpm.NOTA: Para prevenir la contaminación bacteriana en el cultivo celular Sf9, use gentamicina a una concentración final de 10 μg/mL o penicilina/estreptomicina a 50 U/mL y 50 μg/mL, respectivamente. 6. Infección de las células Sf9 con SCBIIS para la producción a gran escala de la proteína Divida 2 L o 4 L de células Sf9 de crecimiento exponencial en medio libre de suero de insectos a una densidad celular final de 4 x 106 células / mL en frascos de agitación Tunair de 2,5 L o botellas de reactivos de 5 L. Añadir 10-12 mL/L del cultivo en suspensión de células de insectos infectados por baculovirus (SCBIIC). Incubar el cultivo infectado de células Sf9 en una coctelera con 145 rpm a la temperatura más baja de 25 °C (para ralentizar la división celular) durante 72-96 h. A las 72 h después de la infección, compruebe las células bajo un microscopio para SOI y evaluar la viabilidad celular. Por lo general, después de aproximadamente 72 h después de la infección, la viabilidad de las células Sf9 cae a 70%-75% (medido con la tinción trypan azul). Cosechar células Sf9 infectadas en una botella de polipropileno de 1 L por centrifugación a 900 x g durante 15 min a 4 °C. Resuspend el pellet celular recogido de 1 L del cultivo celular de producción con 20-25 mL de 1x PBS por arremolinado suavemente y transferencia en tubos cónicos de 50 mL. Gire hacia abajo la suspensión de la célula a 900 x g durante 15 min y deseche la solución de PBS. Resuspend el pellet de células lavadas con 20-25 mL del tampón de suspensión (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 1x cóctel inhibidor de proteasa) y congelación repentina en nitrógeno líquido; almacenar a −80 °C hasta la purificación.NOTA: Los procedimientos de purificación para los PRMTs se han descrito en detalle en el documento publicado por SGC6.