바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

참고: BEVS 프로토콜 단계의 개요는 그림 1에설명되어 있습니다. 1. 재조합 박미드 DNA의 생성 DH10Bac 변환을 위한 LB 한천 선택 판의 준비 50 μg/mL 카나마이신, 7 μg/mL 젠타미신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 200 μg/mL 블루로갈, 40 μg/mL IPTG가 포함된 LB 아가 플레이트를 준비하여 DH10Bac 변환제를 선택합니다. 미리 혼합 된 LB 국물 25 g와 바토 아가 13 g의 무게와 2 L 플라스크에 넣어. 121°C에서 15-30분 동안 증류수와 오토클레이브로 부피를 1L로 가져옵니다. 50°C에서 수조를 설정하고 50-55 °C로 냉각 될 때까지 40- 60 분 동안 수조에서 오토클레이브 된 천용액을 식힙니다. 냉각된 용액에 젠타미신을 7 μg/mL의 최종 농도에 추가하고, 가나마이신을 50 μg/mL의 최종 농도에, 10 μg/mL의 최종 농도에 테트라사이클린, 블루골갈은 최종 농도 200 μg/mL, IPTG를 최종 농도에 40μg/mL로 추가한다. 50mL 파이펫을 사용하여 매질의 천용액과 알리쿼트 7-10mL를 각 60mm 플레이트에 혼합한다. 접시가 실온(2시간)에 앉아서 경화시키게 합니다. 반전, 랩 및 저장 4 °C. 항생제를 함유한 플레이트는 최대 4주 동안 안정적입니다. DH10박 대장균 유능한 세포로 플라스미드의 변형 유능한 셀의 필요한 볼륨을 계산합니다. 얼음에 유능한 세포를 해동하고 부드럽게 회전하고 부드러운 도청으로 다시 중단합니다. 12채널 파이펫을 사용하여 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 세포의 4 μL을 분배합니다. ~ 0.3-0.5 μg의 재조합 플라스미드 DNA를 유능한 세포에 넣고 두드려 부드럽게 섞습니다. 10-15 분 동안 얼음에 혼합물을 배양. 45s에 대한 42 °C에서 PCR 기계에서 혼합물을 열 충격. 얼음에 2 분 동안 식힙니다. 96웰 블록(96-deep well 2.4 mL)의 각 웰에 SOC 배지0.5mL을 분배합니다. 12채널 파이펫을 사용하여 변형된 세균 현탁액을 블록의 해당 우물로 옮기고 에어포어 시트로 덮습니다. 블록을 4-5 h에 대한 중간 동요 (205 rpm)와 함께 37 °C에서 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다. 멸균 유리 구슬을 사용하여 LB 한천 판의 표면에 배양30-50 μL을 균등하게 퍼뜨리는다. 나머지 배양을 4°C에 저장합니다. 파란색/흰색 콜로니의 색상이 식별 될 때까지 37 °C에서 플레이트를 배양 (40-48 h). 충분한 흰색, 큰 식민지가 접시에 얻을 때 문화를 폐기. 백색 식민지가 재조합 bacmid DNA만 포함되도록 하기 위하여는, 항생제, bluo-gal 및 IPTG를 포함하는 신선한 LB 한 천 접시에 1개의 고립된 백색 식민지를 재줄이 그형을 확인하기 위하여. 37 °C에서 48 h에 대한 인큐베이션. 재조합 바미드 DNA의 추출을 위해 다시 줄무늬 접시에서 검증 된 흰색 식민지 하나를 선택합니다. 분리 재조합 박미드 DNA 단 하나, 절연 된 흰색 식민지를 LB 중간 크기의 3mL로 접종하여 50 μg / mL 카나마이신, 7 μg / mL 젠타미신 및 24 웰 블록 (24 웰 블록 라운드 바닥)에서 10 μg / mL 테트라 사이클린을 보충하고 에어포어 시트로 덮습니다. 250 rpm에서 흔들면서 하룻밤 사이에 37 °C에서 자랍니다. 원심 분리기 24 웰 블록에서 2,100 x g에서 10 분 동안. 상체를 데수화하고 블록을 반전시키고 흡수성 티슈 페이퍼를 부드럽게 누릅니다. 각 웰에 용액 1(셀 리서스펜션 용액)의 250 μL을 추가합니다. 테이프 패드 또는 기타 밀봉 필름으로 블록을 밀봉하고 5-10 분 동안 75 rpm의 흔들리는 플랫폼에 배치하십시오. 각 우물을 확인하여 적절한 셀 용해를 확인하고 필요한 경우 1mL 팁을 사용하여 다시 중단하십시오. 각 우물에 250 μL(셀 용액)을 추가하고, 블록을 밀봉하고, 30s(시료의 교차 오염을 피하기 위해, 24웰 블록을 반전하지 않음)에 대해 75 rpm의 흔들림 플랫폼에 배치하여 4분 동안 실온에서 인큐베이팅합니다. 용액 3(중화 용액)의 250 μL을 추가하고 블록을 밀봉하고 흔들림 플랫폼에 30s로 놓습니다. 단백질과 대장균 게놈 DNA의 두꺼운 백색 침전이 형성됩니다. 샘플을 얼음 위에 10-15분 간 놓습니다. 4°C에서 2,100 x g에서 60분 동안 원심분리기를 사용하여 백색 침전물 물질을 단단히 pellet합니다. 원심 분리 하는 동안, 새로운 미세 원심 분리 기 튜브를 레이블 및 절대 이소 프로 판 올의 0.8 mL를 추가. 상체를 이소프로판올이 함유된 튜브로 부드럽게 이송하여 백색 침전 물질을 피합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전한 다음 얼음 위에 5~10분 동안 놓습니다. 이 단계에서, 샘플은 하룻밤 -20 °C에서 저장 될 수있다. 원심 분리기 는 4 °C에서 14,000 x g에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 각 튜브에 70 %의 에탄올의 0.5 mL을 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전하여 펠릿을 씻으십시오. 상온에서 14,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. (선택 사항: 반복 세척) 플라스미드 제제의 멸균을 보장하고 가능한 한 많은 상체를 제거하기 위해 라미나르 플로우 후드 내부에 샘플을 가져옵니다.참고: 펠릿은 튜브 의 바닥에서 빠질 수 있으므로 상퍼를 버릴 때 펠릿을 주의 깊게 관찰하십시오. 15-20분 동안 라미나르 플로우 후드 내부의 펠릿을 공기 건조시키고 여과된 용출 버퍼, 10mM Tris-Cl, pH 8.5의 50 μL에서 DNA를 용해시킵니다(펠릿이 과도하게 건조되지 않았는지 확인하십시오). 재조합 박미드 DNA는 크기가 135 kb보다 크므로 DNA의 전단을 피하기 위해 부드러운 도청으로 펠릿을 녹입니다. 박미드 DNA에 대한 관심 유전자의 존재를 확인하기 위해, 96웰 PCR 플레이트에 PCR 반응 믹스를 설정한다. 다음과 같이 PCR 믹스를 준비하십시오: 완충의 1μL, dNTPs의 0.2 μL (10 mMM 각), Taq DNA 폴리머라제의 0.1 μL, 0.1 μL (25 μM) 전방 및 역 프라이머 (BACV2FWD: tattccggattattcatcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc, 1 μL 의 바미드 DNA 및 8 μL의 물. 95°C에서 2분 동안 초기 내분으로 표적 유전자의 증폭을 수행하고, 30초동안 94°C의 25사이클, 30초동안 55°C, 1분/kb에 72°C가 그 뒤를 이었다. 72°C에서 7분 동안 최종 연장 후 반응을 종료한다. 증폭 제품의 10 μL을 전기포고증에 의한 핵산 염색 용액을 함유한 아가로즈 겔을 1% (w/v) 분석한다. 검증된 박미드 DN을 4°C에 저장합니다. 2. 재조합 바큘로바이러스 주식의 세대 참고: 바쿨로바이러스 생성, 바큘로바이러스 볼륨 증폭, 단백질 발현 스크리닝 및 단백질 생산을 위한 세포 형질 전환을 포함하여 바쿨로바이러스 발현 프로토콜의 모든 단계에 대해 95% 이상 생존력을 가진 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 사용합니다. 제트프라임 또는 X-tremeGENE 9와 같은 박미드 DNA 및 트랜스페션 시약(T.R.)을 가진 Sf9 세포의 배설.참고: Trypan Blue 염색 및 혈혈계를 사용하여 셀 수와 셀 생존 가능성을 결정할 수 있습니다. 실행 불가능한 세포는 얼룩을 취하고 실행 가능한 세포가 얼룩지지 않은 채로 남아 있는 동안 현미경의 밑에 청색으로 나타납니다. % 세포 생존가능성을 계산하기 위해, 총 세포 수가 얻어져(얼룩이 없는 염색) 및 실행 가능한 세포 수는 총 세포 수로 나누어지고 100을 곱한다. 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 혈청 없는 곤충 매체에서 4 x 105 세포/mL의 최종 세포 밀도로 희석하고 멸균 시약 저장소에 부어 넣습니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 Sf9 세포의 0.5mL를 시드하는 프로그래밍 가능한 멀티채널 파이펫을 사용합니다. 플레이트의 우물을 대조군(trans감염되지 않은)으로 라벨을 부착하고 감염의 잠재적 징후를 평가하기 위해 감염및 비감염된 세포를 비교하는 대조군으로 사용합니다. 세포를 접시에 파종한 후, 접시를 여러 번 부드럽게 흔들어 세포의 단층도 보장합니다. 셀이 우물의 중심으로 클러스터되므로 플레이트를 소용돌이지 마십시오. 배양 판에 세포 부착을 허용하기 위해 적어도 1 h에 대해 27°C에서 플레이트를 배양한다. 트랜스펙트 시약 바이알을 잘 섞는다. 각 트랜스펙트에 대해, 트랜스펙트 시약의 2 μL을 트랜스펙트 버퍼의 100 μL에 추가합니다. 다른 보충 되지 않은 곤충 매체도 사용할 수 있습니다. 희석된 형질 전환 시약을 멸균 시약 저장소에 보관하고 10s에 부드럽게 섞습니다. 12채널 파이펫을 사용하여 희석된 월화 시약의 102 μL을 멸균 96 마이크로웰 플레이트로 이송합니다. 재조합 바미드 DNA의 0.2 μg/μL 용액의 10 μL을 96웰 마이크로웰 플레이트의 해당 우물로 옮기고 양면에서 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합한다. 복잡한 형성을 가능하게 하기 위해 15-20 분 동안 형체 혼합물을 배양합니다. 96-24웰 플레이트 사이를 전송하도록 설계된 조정 가능한 6채널 파이펫을 사용하여, 세포에 경질 혼합물을 분리하여 해당 경질 플레이트의 해당 우물에 추가하고 27°C에서 4-5h의 배양한다. 배양 시간 동안 플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들어 세포 단층 위에 배분 혼합물의 균일한 분포를 보장합니다. 4-5 회제 후, 1.5mL의 곤충 혈청 프리 배지를 10% (v/v) 최종 열불불성 태아소 혈청과 항생제 항마이코틱의 최종 부피(페니실린 100단위/mL, 100μg/mL, 연쇄상 구균 0.25mL)로 첨가한다. 72-96 h용 27°C 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 가능하면 하루에 한 번 부드럽게 전환 판을 흔들어 주세요. 감염의 징후를 찾습니다 (SOI), 72-96 h 후 트랜스페션에서 전염 된 세포에서 분명(그림 2). 감염된 세포가 바이러스를 생성하기 시작하고 배양을 더 감염시킬 것이라는 점을 명심하십시오. 따라서 감염의 징후를 찾습니다.참고: 감염의 징후는 세포 직경의 25-50% 증가, 확대된 세포 핵, 균일하게 둥근 형상, 배양 접시 표면에 대한 증식 및 준수의 손실, 세포 생존율 의 감소 와 같은 곤충 세포의 구조적 변화이다(도2. 바쿨로바이러스 감염 및 감염되지 않은 Sf9 세포). 3. 작은 – 스케일 단백질 발현 스크리닝 및 바이러스 증폭 P1 바쿨로바이러스 주식을 가진 Sf9 세포의 감염.참고: 4-5 일 경과 후, 감염의 표시는 반전된 현미경의 밑에 통제 (transtrans감염되지 않은) 세포에 비교될 때 전염된 세포에서 분명해야 합니다. 세포 배양 배지로 분비된 초기 재조합 바큘로바이러스는 수집할 준비가 되어 있어야 한다. 종자 2 x105 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포는 P1 바이러스감염에 대한 총 24웰 플레이트의 24웰 플레이트의 각 우물로 혈청이 없는 곤충 매체로 바이러스 부피를 증폭시키는 결과(P2 바이러스의 생성의 결과). 플레이트에 세포를 파이프를 넣은 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 앞뒤로 움직여 균일한 단층이 되도록 합니다. 셀이 우물의 중심으로 클러스터되므로 플레이트를 소용돌이지 마십시오. 플레이트에 세포 준수를 허용하기 위해 플레이트를 최소 1h에 대해 27°C에서 배양합니다. Sf9 세포의 4mL을 3.5-4 x 106의 밀도로 곤충 혈청 이없는 배지에 24웰 블록의 각 웰에 분배하여 단백질 발현 스크리닝을 위한 P1 바이러스에 감염시다.참고: SOI를 찾고 있을 때 감염되지 않은 세포와 감염되지 않은 세포의 비교를 위해 24웰 플레이트와 24웰 블록 중 하나를 대조군으로 표시하고 감염되지 않은 대조군으로 사용하십시오. P1 바이러스(단계 2.1.13), 갓 시드된 Sf9 세포의 감염(3.1.1) 감염, P1 바이러스의 150μL을 가진 24웰 블록(Step 3.4)에서 현탁세포의 감염을 동시에 수집할 수 있도록 프로그래밍 가능한 전자 멀티채널을 사용합니다. 수집된 P1 바이러스 성 주식의 나머지 부분을 17,970 x g에서15 분 동안 스핀 다운하고 마이크로 센심 분리튜브로 옮기고 4 ° C에서 어둠 속에서 저장하십시오. 보답 셰이커에 24웰 플레이트(Step 3.1.1)를 부드럽게 흔들어 세포 단층 위에 추가된 P1 바이러스의 균등한 분포를 보장합니다. 인큐베이션 시간 동안 이 것을 몇 번 반복합니다. 에어포어 시트로 감염된 Sf9 세포(3.1.4단계)의 현탁액 배양으로 24웰 블록을 덮는다. 27°C에서 24웰 블록을 배양하고 72-96 h의 경우 245rpm에서 흔들어 보배합니다. P2 바이러스를 가진 24웰 플레이트(Step 3.1.1)와 발현 스크리닝을 위한 감염된 세포를 가진 24웰 블록(Step 3.1.4)에서 감염 시간 후 72-96h 이내에 SOI를 찾아본다.참고: P1 바이러스를 가진 Sf9 세포의 감염 후에 4-5 일, SOI는 반전된 현미경의 밑에 비감염된 통제 세포에 비교될 때 감염된 세포에서 분명해야 합니다. 24웰 플레이트에서 P2 바이러스를 수집하고 원심분리기는 17,970 x g에서15분 동안 원심분리기를 수집하여 미세원심분리관으로 옮기고 4°C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 72-96 h 에서 감염 후, 70 % 에탄올24 웰 블록 에탄올을 통해 스프레이, 라미나르 흐름 후드에 가져와, Trypan 블루 염색에 의해 몇 우물에서 세포 밀도와 생존가능성을 확인합니다. 세포가 감염의 징후가 있고 생존가능성이 Trypan Blue 염색에 의해 평가된 대로 70-75%에 가까우면 단백질 정화로 진행하십시오. 15 분 동안 4 °C에서 525 x g에서 24 웰 블록을 원심 분리하여 세포를 펠렛. 25m Tris pH 8.0으로 구성된 용해 버퍼 1mL에서 상체를 폐기하고 펠릿을 철저히 다시 중단하고, 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM imidazole, 5 % 글리세롤 (v /v) 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (100x 프로테아제 억제제 칵테일은 아프로틴 0.25 mg /mL, leupeptin 0.25 mg/mL; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin A.mL; pepstatin A.mL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin AL 0.25 mg; pepstatin AL; pepstatin A.25 mg; pepstatin A.25 mg; pepstatin A.mL; pepstatin A.ml; E-64 0.25 mg/mL). 후속 시험 정화를 위해 셀 서스펜션을 -80°C에 저장합니다(3.2.2 참조). 24웰 테스트 발현 블록에서 냉동 세포 서스펜션으로부터 단백질 정제. 바인딩 블록의 어셈블리(도 3). 96-deep 웰 블록(96-deep well 2.4 mL)의 상단에 파라필름 3겹겹으로 배치합니다. 96웰 필터 플레이트(필터 마이크로플레이트, 96웰, 폴리프로필렌 25μm 초고분자량 폴리에틸렌 멤브레인)을 96-딥 웰 블록 위에 놓습니다. 필터 플레이트를 아래로 밀어 파라필름에 팁을 고정하여 96웰 의 깊은 블록에서 필터 플레이트를 밀봉합니다. 사전 평형 50% Ni-NTA 수지 슬러리의 50 μL을 필터 플레이트의 각 웰에 옮기. 테스트 식 프로시저 5-10 분 동안 RT의 수조에 24 웰 블록에 존재하는 냉동 셀 서스펜션 (3.1.15 단계)을 놓고 20 분 동안 450 rpm에서 흔들어줍니다. 원심 분리기 는 15 분 동안 3,275 x g에서 24 웰 블록. 멀티채널 파이펫을 사용하여 클리어리리를 50μL의 50μL를 포함하는 필터 플레이트로 옮기고 50% Ni-NTA 수지 슬러리(3.2.1.4단계)를 포함하고 필터 플레이트를 96웰 캡 매트(96웰 캡 매트, 사각형 과 2mL와 함께 사용)로 밀봉한다.참고: 몇 개의 고무 밴드를 사용하여 인큐베이션 및 원심 분리 단계에서 바인딩 블록을 함께 유지합니다. 45-60분 동안 보안 바인딩 블록을 콜드 룸의 회전에 넣고 Ni-NTA 수지로 클리어된 용액을 배양합니다. 인큐베이션 후, 필터 플레이트를 조심스럽게 들어 올려 96-딥 웰 블록(3.2.1.1 단계)의 표면에서 파라필름 층을 제거합니다. 필터 플레이트를 96-deep 웰 블록 위에 다시 놓고 235 x g에서 2 분 동안 고정 바인딩 블록을 회전하십시오. 워시 본드 Ni-NTA 수지 2x와 2mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 15m imidazole로 구성된 세탁 버퍼 2mL. 235 x g에서 5 분 동안 세척 버퍼로 블록을 회전하여 잔류 액체를 완전히 제거하십시오. 4배 적재염의 10μL을 포함하는 96웰 PCR 플레이트 의 상단에 필터 플레이트를 옮김한다. 용출 버퍼 40 μL(25m Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 500mM imidazole)을 필터 플레이트의 각 웰에 넣고 5분 동안 인큐베이트합니다. 블록을 아래로 회전하여 단백질을 10분 동안 235 x g의 96웰 PCR 플레이트로 밀어 넣습니다. 고온 내성 탭 패드와 열로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하여 98°C에서 3분 동안 가열하십시오. 단백질 사다리 옆에 있는 4-20% SDS-PAGE 젤에 표준 Laemmli 버퍼에 15 μL의 eluted 단백질 샘플을 적재하고 SDS를 포함하는 표준 실행 버퍼로 젤을 실행합니다. 쿠마시 블루와 드 스테인물로 젤을 더럽습니다. 테스트 식의 결과를 분석하여 대규모 생산을 위한 최상의 표현 구인을 식별합니다. 4. 단백질 생산을 위한 바쿨로바이러스 감염 곤충 세포(SCBIIC)의 제제 예정된 생산 시간 4일 전에, 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포를 2 x 106 세포/mL의 최종 세포 밀도로 분할하여 125mL/250mL/500mL/500mL 에렌마이어 유리 쉐이크 플라스크로 50mL/100mL/200mL의 곤충 혈청-프리 배지(100mL)를 함유하고 있다. 적절한 P2 바이러스의 0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL을 추가하고, 1 인치 스트로크를 가진 궤도 셰이커에 165 rpm에서 감염된 세포를 배양하고 25 °C의 낮은 온도에서 세포 분열을 느리게한다. 4일 감염 후, SOI현미경으로 세포를 확인하고 Trypan Blue 얼룩으로 확인된 세포 생존가능성이 70~75%에 가까우면 생산을 진행한다. 5. 대규모 단백질 생산을 위한 Sf9 세포 제제 예정된 생산 시간 4일 전에 대규모 단백질 생산을 위해 Sf9 세포의 필요한 부피를 계산합니다. 종자 2 L은 곤충 혈청 프리 배지에서 Sf9 세포를 기하급수적으로 성장시키는 세포밀도에서 1 x 106 셀/mL의 세포 밀도로 2.8 L Fernbach 쉐이크 플라스크에 있다. 150 rpm에서 흔들림 세트와 27 °C에서 인큐베이션 플라스크.참고: Sf9 세포 배양에서 세균 오염을 방지하기 위해 젠타미신을 10 μg/mL 또는 페니실린/연쇄절제술신에서 각각 50개의 U/mL 및 50 μg/mL의 최종 농도로 사용합니다. 6. 대규모 단백질 생산을 위한 SCBIIS를 가진 Sf9 세포의 감염 2.5 L 툰에어 쉐이크 플라스크 또는 5 L 시약 병에 4 x 106 세포/mL의 최종 세포 밀도로 곤충 혈청 없는 매체에서 기하급수적으로 성장하는 Sf9 세포의 2 L 또는 4 L을 분할한다. 바쿨로바이러스감염 곤충세포(SCBIIC) 현탁액 배양의 10-12mL/L을 추가한다. 72-96h에 대해 25°C의 낮은 온도 (세포 분열을 늦추기 위해)에서 145 rpm으로 셰이커에 Sf9 세포의 감염된 배양을 배양합니다. 72 h 감염 후, SOI에 대 한 현미경에서 세포를 확인 하 고 세포 생존가능성을 평가. 일반적으로, 약 72 h 감염 후, Sf9 세포의 생존력은 70%-75%로 떨어집니다(Trypan Blue 얼룩을 사용하여 측정). 4°C에서 15분 동안 900 x g에서 원심분리로 1L 폴리프로필렌 병에 감염된 Sf9 세포를 수확하십시오. 부드럽게 소용돌이와 50 mL 원문 튜브로 전송하여 1 x PBS의 20-25 mL의 생산 세포 배양의 1 L에서 수집 된 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션을 900 x g에서 15분 동안 회전시키고 PBS 용액을 폐기하십시오. 서스펜션 버퍼의 20-25 mL (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 x 프로테아제 억제제 칵테일)로 세척 된 세포 펠릿을 다시 중단하고 액체 질소에서 플래시 동결; 정제 될 때까지 – 80 °C에서 저장합니다.참고: PrMT에 대한 정화 절차는 SGC 출판 논문6에서자세히 설명되었습니다.