Summary

Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

Published: November 06, 2021
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Summary

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o uso de um dispositivo de fabricação de grade rápida tanto para a fabricação rápida de grade quanto para a rápida mistura e congelamento para realizar experimentos resolvidos pelo tempo.

Abstract

O campo da microscopia crio-elétron (crio-EM) está se desenvolvendo rapidamente com novos algoritmos de hardware e processamento, produzindo estruturas de maior resolução e informações sobre sistemas mais desafiadores. A preparação da amostra para crio-EM está passando por uma revolução semelhante com novas abordagens sendo desenvolvidas para substituir os sistemas tradicionais de manchas. Estes incluem o uso de distribuidores piezo-elétricos, impressão de pinos e pulverização direta. Como resultado desses desenvolvimentos, a velocidade de preparação da rede está indo de segundos a milissegundos, proporcionando novas oportunidades, especialmente no campo do crio-EM resolvido no tempo, onde proteínas e substratos podem ser rapidamente misturados antes do congelamento do mergulho, prendendo estados intermediários de curta duração. Aqui descrevemos, em detalhes, um protocolo padrão para fazer grades em nosso dispositivo EM resolvido no tempo interno, tanto para preparação padrão de grade rápida quanto para experimentos resolvidos com o tempo. O protocolo requer um mínimo de cerca de 50 μL de amostra em concentrações de ≥ 2 mg/mL para a preparação de 4 grades. O atraso entre aplicação da amostra e congelamento pode ser tão baixo quanto 10 ms. Uma limitação é o aumento da espessura do gelo em velocidades mais rápidas e comparado com o método de mancha. Esperamos que este protocolo ajude outros a projetar seus próprios dispositivos de fabricação de grade e aqueles interessados em projetar experimentos resolvidos com o tempo.

Introduction

Fundo
Desenvolvimentos recentes na microscopia crio-elétron (crio-EM) permitiram estudos estruturais de sistemas cada vez mais complexos em alta resolução. Com poucas exceções, tais estudos têm sido limitados a macromoléculas biológicas em equilíbrio1 ou reações relativamente lentas2. Muitos processos in vivo ocorrem em uma escala de tempo mais rápida (milissegundos) e há um interesse crescente em crio-EM (TrEM) resolvidos no tempo nessas escalas de tempo3. No entanto, a preparação convencional da amostra crio-EM pelo método de manchas é muito lenta para o TrEM de milissegundo.

O método de mancha tem outras limitações além da baixa resolução de tempo. Proteínas e complexos proteicos podem sofrer de desnaturação ou orientação preferencial nas redes4. A redução do tempo de exposição à interface ar-água durante a preparação da amostra tem sido demonstrada para mitigar a orientação preferida e a desnaturação proteica5,6. Assim, a preparação rápida da grade não só permite o TrEM de milissegundos, mas também pode melhorar a qualidade da grade.

Atualmente, existem três abordagens diferentes para a preparação automatizada da rede. A primeira abordagem usa um pino ou capilar que contém uma pequena quantidade de amostra. Após estabelecer contato entre o líquido e a superfície da grade, a amostra é ‘escrita’ na grade7,8. O processo de aplicação da amostra é relativamente lento e leva alguns segundos. Uma abordagem alternativa usa a geração de gotículas controladas por um distribuidor piezo e grades auto-wicking9. Isso permite dispensar mais rapidamente os tempos de congelamento, mas ainda é limitado pela velocidade de gotícula e pavio (atualmente atingindo 54 ms). A abordagem mais rápida até agora é a abordagem direta de pulverização, na qual a amostra é atomizada em um bocal de spray e as gotículas pequenas (~ 10 – 20 μm) e rápidas (> 5 m/s) espalhadas após o contato com a grade crio-EM. O spray de amostra pode ser gerado de diferentes maneiras, como atomizadores do airblast, ondas acústicas de superfície ou umidificadores ultrassônicos10,11,12,13. Em nossa experiência, a espessura do gelo com a abordagem de pulverização direta é maior, mas a pulverização direta permite dispensar vezes < 10 ms.

Este protocolo descreve passo a passo como um dispositivo EM (TED) resolvido com o tempo equipado com um bocal de pulverização microfluido pode ser usado para preparar grades em uma escala de tempo rápida14,15. O dispositivo tem sido usado para preparar grades com um tempo mínimo de atraso de 6 ms entre aplicação da amostra e congelamento e para misturar e congelar rapidamente duas amostras. O design do TED é baseado em uma versão anterior16 e é semelhante a outros dispositivos crio-EM resolvidos com spray17.

Primeiro, as quatro partes principais da configuração TED são descritas. O núcleo do TED é a unidade de manuseio líquido, que é responsável pela aspiração e dispensação da amostra. Um êmbolo pneumático move a grade através do spray para o etano líquido. A geração do spray é alcançada com bicos de spray microfluidos e o congelamento é feito em um recipiente de etano líquido, que são descritos brevemente. Por fim, destacam-se as características adicionais para controlar o ambiente da rede, especialmente a umidade. Isso é seguido por protocolos detalhados para o funcionamento do dispositivo e para a realização de experimentos TrEM. Os resultados representativos são dados para a preparação rápida da grade e um simples experimento TrEM.

Configuração experimental

A unidade de manuseio líquido
O sistema de manuseio líquido do TED é formado por três bombas de acionamento de seringa (‘bombas 1 – 3’), cada uma equipada com uma válvula rotativa(Figura 1). Uma fonte de alimentação fornece bombas 1 – 3 com DC 24 V. A comunicação com o software de controle (escrito em Visual Basic e C++) é através de uma interface RS232 para bombear 1. Os comandos são distribuídos através das portas de expansão de I/O serial da bomba 1 às bombas 2-3. As bombas 1-3 são equipadas com seringas de vidro (seringas de vidro 1-3′, usamos 250 seringas de volume morto 250 μL/zero aqui). Cada válvula tem duas posições, ‘carregar’ e ‘dispensar’. A posição ‘carga’ é usada para aspirar amostra na seringa. Uma peça curta (~ 3 – 4 cm) de 1/16″ O.D., 0,01′′ A tubulação FEP é conectada através de encaixes ETFE/ETFE flangeless à posição de ‘carga’ das válvulas 1-3. Este pequeno pedaço de tubulação atinge o reservatório de amostras (tipicamente um tubo plástico de 1,5 mL ou 0,5 mL). A posição ‘dispensar’ leva ao bocal de pulverização. A conexão entre a tomada ‘dispense’ e o bocal de spray é feita por tubos pe (~ 20-30 cm de comprimento, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), com um pequeno pedaço de tubo de manga (~ 0,5 cm) e encaixes etfe/ETFE flangeless.

O êmbolo pneumático
O TED usa um êmbolo pneumático para acelerar a rede e movê-la através do spray de amostra para o recipiente de etano líquido. Pinças de pressão negativa seguram a grade, aparafusadas em um suporte construído em casa que é montado em um cilindro pneumático de haste dupla(Figura 2A).

A pressão é fornecida a partir de um grande cilindro de gás nitrogênio (tamanho W), equipado com um regulador multiestáquia (0 -10 bar, ‘pressão principal’). A tubulação de PVC reforçado flexível (12 mm O.D.) conecta o regulador a um coletor de 12 portas onde o nitrogênio pressurizado é entregue ao bocal e ao êmbolo pneumático. O fluxo de gás através do bocal é constante, regulado diretamente no cilindro de nitrogênio (pressão principal). A conexão com o bocal é feita com tubos PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), um pequeno pedaço de tubo de PE (~ 8 cm de comprimento, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) e conectores apropriados. A pressão no êmbolo pneumático é controlada através de uma válvula solenoide. O tubo PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) conecta a válvula solenoide com um regulador e o êmbolo pneumático, para permitir uma pressão de mergulho reduzida (≤ pressão principal). A válvula solenoide é controlada por computador. Uma visão geral esquemática da configuração é dada na Figura 2B.

Observe que com esta configuração a pressão de mergulho é sempre igual ou menor do que a pressão do gás de pulverização (pressão principal). No entanto, a configuração pode ser facilmente alterada incorporando um segundo regulador a montante do bocal de pulverização para permitir velocidades de mergulho mais altas em baixa pressão de gás de pulverização. Altas pressões (>> 2 barras) podem danificar o bocal de spray PDMS.

ATENÇÃO: Trata-se de um sistema pressurizado e a “pressão principal” deve ser sempre < 7 bar.

Pressões entre 0,5 e 2 barras são tipicamente usadas para o êmbolo pneumático e mostram uma relação aproximadamente linear entre pressão e velocidade (na posição vertical do spray). As velocidades de mergulho são medidas com um osciloscópio, conectado em linha com um potencializador de slides (10 kΩ) e em paralelo com um resistor de 2 kΩ(Figura 2C). Uma fonte de alimentação fornece o potencialiômetro com 9 V DC. Enquanto a velocidade de mergulho aproximada é definida antes do experimento, definindo a pressão de mergulho, o potencialiômetro dá uma leitura precisa da velocidade após o experimento.

Bicos de spray e recipiente de etano líquido
A fabricação e operação de bicos virtuais dinâmicos a gás para entrega de amostras baseadas em spray foi descrita em outros lugares no detalhe15. Como descrito acima, as saídas ‘dispensar’ das válvulas 1-3 estão conectadas às entradas líquidas do bocal(Figura 3A). O gás pressurizado está conectado à entrada de gás do bocal. As entradas nos bicos de spray PDMS são tais que a tubulação de PE de 0,043″ pode ser usada diretamente sem a necessidade de conexões. Nosso design de bocal contém uma geometria “jet-in-jet” para a mistura de duas amostras, semelhante ao dispositivo descrito no ref.18. Um esquema do design é mostrado na Figura 3B, uma imagem microscópica de um bocal é mostrada na Figura 3C. O layout do dispositivo microfluido requer o uso de três seringas para misturar duas amostras. O bocal de pulverização é normalmente posicionado a 1-1,5 cm de distância da grade (durante a aplicação da amostra).

Usamos etano líquido como criogen, em um recipiente líquido de etano/nitrogênio, como usado para o método padrão de manchas. O posicionamento vertical do copo de etano líquido é alcançado com uma plataforma de elevação de laboratório.

Controle do ambiente de pulverização e grade
O bocal de êmbolo e spray estão contidos dentro de uma caixa pmma personalizada (vidro acrílico) com uma porta dupla(Figura 4A). A alta umidade relativa dentro da caixa é alcançada por um sistema de umidificação do ar na parte de trás do TED (Figura 4B). O ar é fornecido por uma bomba e alimentado em um primeiro recipiente de 10″ (normalmente usado para purificação de água do pia). O recipiente é preenchido com um nível baixo (~ 5-10 cm) de água e também abriga uma unidade umidificador. A potência da rede do umidificador é controlada por um controlador de umidade/temperatura digital e um sensor de umidade/temperatura localizado dentro da caixa de vidro acrílico. O controlador está pronto para desligar a bomba quando a umidade relativa atingir ≥ 90 %. O ar umidificado do primeiro recipiente é bombeado através de um difusor, imerso em água em um segundo recipiente de 10″ e, em seguida, entra na caixa de vidro acrílico.

ATENÇÃO: Como a amostra é aerossolizada no bocal de spray, amostras biológicas ou químicas perigosas não são adequadas como amostras.

A sequência de execução
O botão Executar script no software de controle inicia a sequência de execução. Esta sequência de comandos pode ser pré-definida em um arquivo de script e alterada através do software. As variáveis mais importantes são explicadas aqui:

Velocidade do spray: A velocidade do pulverizador determina a taxa de fluxo de líquido usada pela bomba de seringa. A taxa de fluxo pode ser calculada da seguinte forma: Os motores da bomba de seringa utilizados aqui têm um tamanho de passo fixo. A gama completa da bomba é dividida em 48.000 passos. O segundo fator importante é o volume da seringa. Normalmente usamos seringas de 250 μL. A velocidade de pulverização no software de controle é definida como número de passos/segundo. Uma velocidade de pulverização de 1000 passos/segundo corresponde a:

Equation 1

Volume de pulverização: O volume do spray determina o volume total a ser pulverizado. Assim, também determina a duração do spray. O volume de pulverização no software de controle é definido como uma série de etapas. Um volume de pulverização de 2000 passos, a uma velocidade de pulverização de 1000 passos/segundo, leva a uma duração de pulverização de 2 s e um volume total de 10,4 μL.

Tempo de pré-pulverização: Esta variável define o tempo entre o início do spray e o mergulho. É importante escolher o tempo de atraso para que o spray tenha tempo suficiente para estabilizar antes de mergulhar na grade. Normalmente, o spray é dado 1,5 – 4 s para estabilizar antes que a grade seja mergulhada. O spray é mantido até que a rede se move. Normalmente, o fluxo líquido (e, portanto, o spray) é interrompido de 0,5 a 1 s depois que a rede foi mergulhada. Usando uma velocidade de pulverização de 1000 passos/s e um volume de spray de 2000 passos, um tempo típico de pré-pulverização é de 1,5 s, por exemplo.

Uma sequência exemplar de comandos é mostrada na Figura 5A, a posição da grade ao longo do tempo é ilustrada na Figura 5B.

Protocol

1. Preparando o sistema NOTA: O protocolo a seguir descreve como preparar grades de uma única amostra. Normalmente, um mínimo de 2 grades de replicação são preparados para cada amostra ou condição. Para velocidades de mergulho mais rápidas (menos de ~ 20 ms de atraso de tempo), 3 ou 4 redes de réplica são tipicamente preparadas para explicar um número reduzido de áreas de gelo finas. Diluir a amostra de proteína para a concentração alvo no buffer desejado. Normalmente,…

Representative Results

Preparação rápida da grade com o TEDComo uma amostra de teste para preparação rápida da grade, usamos apoferritina do baço de equino a 20 μM em 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. Uma reconstrução com resolução de 3,5 Å foi obtida a partir de 690 micrografos descritos no ref.15 (Figura 7A). A faixa de desfocus foi escolhida para que as partículas possam ser facilmente identificadas nas imagens brutas(Figura 7B</str…

Discussion

Os protocolos neste trabalho podem ser usados para preparação rápida da grade por pulverização direta e experimentos TrEM. A preparação rápida da grade pode ser usada para reduzir as interações de partículas com a interface de água do ar5. As principais limitações são a concentração amostral disponível e a espessura do gelo na rede. Dentro desses limites e desde que a qualidade da amostra seja boa, o protocolo produz grades adequadas para crio-EM de alta resolução.

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Molly S.C. Gravett por discussões úteis e a equipe de instalações da ABSL por ajuda com a coleta de dados crio-EM. David P. Klebl é um estudante de doutorado no programa de doutorado de 4 anos da Wellcome Trust no Centro Astbury financiado pela Universidade de Leeds. Os microscópios FEI Titan Krios foram financiados pela Universidade de Leeds (prêmio UoL ABSL) e Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Este trabalho foi financiado por uma subvenção do BBSRC para Stephen P. Muench (BB/P026397/1) e apoiado por bolsas de pesquisa para Howard D. White da American Heart Association (AMR21-236078) e Howard D. White e Vitold Galkin dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (171261).

Materials

Time resolved device
acrylic glass box USA scientific
digital humidity/temperature controller THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder dual rod pneumatic cylinder TN 10×70
FEP tubing Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply Mean Well GSM160A24-R7B
power supply Wanptek KPS305D power supply
PU tubing SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer PS100 slide potentiometer
solenoid valve SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen Sigma-Aldrich, A3660
ATP Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA Sigma Aldrich E3889
F-actin Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES Sigma-Aldrich, H7006
KAc Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2 Sigma-Aldrich, M8266
MOPS Sigma-Aldrich, M1254
NaCl Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1 Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
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Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (177), e62199, doi:10.3791/62199 (2021).

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