Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

Фон
Последние разработки в области криоэлектронотерапии (крио-ЭМ) позволили пролисть структурные исследования все более сложных систем с высоким разрешением. За редким исключением, такие исследования были ограничены биологическими макромолекулами при равновесии¹ или относительно медленными реакциями^2. Многие процессы in vivo происходят в более быстрой временной шкале (миллисекунды), и на этих временных масштабах³растет интерес к крио-ЭМ с временным разрешением (TrEM). Однако обычная крио-ЭМ подготовка образцов методом блоттинга слишком медленная для миллисекундного TrEM.

Метод блоттинга имеет и другие ограничения, помимо плохого разрешения по времени. Белки и белковые комплексы могут страдать от денатурации или предпочтительной ориентации на сетках^4. Было показано, что сокращение времени воздействия на воздушно-водную границе раздела во время пробоподготовки смягчает предпочтительную ориентацию и денатурацию белка^5,6. Таким образом, быстрая подготовка сетки не только обеспечивает миллисекундный TrEM, но и может улучшить качество сети.

В настоящее время существует три различных подхода к автоматизированной подготовке сети. Первый подход использует штырь или капилляр, который содержит небольшое количество образца. После установления контакта между жидкостью и поверхностью сетки образец «записывается» на сетку^7,8. Процесс подачи примера заявки относительно медленный и занимает несколько секунд. Альтернативный подход использует контролируемую генерацию капель с помощью пьезодиспенсера и самовосхваляющихся сеток^9. Это позволяет быстрее дозировать время замерзания, но по-прежнему ограничено скоростью капель и впитывания (в настоящее время достигающей 54 мс). Самым быстрым подходом до сих пор является подход прямого распыления, при котором образец распыляется в распылительном сопле и небольшие (~ 10 – 20 мкм) и быстрые (> 5 м / с) капли распространяются при контакте с крио-ЭМ сеткой. Образец распыления может быть получен различными способами, такими как аэростойные атомайзеры, поверхностные акустические волны или ультразвуковые увлажнители^10,11,12,13. По нашему опыту, толщина льда при прямом распылении больше, но прямое распыление позволяет дозировать время замерзания < 10 мс.

Этот протокол описывает пошаговое описание того, как эм-устройство с временным разрешением (TED), оснащенное микрофлюидным распылительным соплом, может быть использовано для подготовки сеток в быстрой шкале^{времени 14,15.} Устройство использовалось для подготовки сеток с минимальным временем задержки 6 мс между нанесением образца и замораживанием, а также для быстрого смешивания и замораживания двух образцов. Конструкция TED основана на предыдущей версии¹⁶ и аналогична другим крио-ЭМ устройствам¹⁷на основе распыления с временным разрешением.

Во-первых, описываются четыре основные части установки TED. Ядром TED является блок обработки жидкости, который отвечает за аспирацию и дозирование образцов. Пневматический плунжер перемещает сетку через распыление в жидкий этан. Генерация спрея достигается с помощью микрофлюидных распылительных форсунок, а замораживание производится в жидком этановой емкости, которые кратко описаны. Наконец, выделены дополнительные функции для контроля среды сетки, особенно влажности. За этим следуют подробные протоколы работы устройства и проведения экспериментов TrEM. Репрезентативные результаты приведены для быстрой подготовки сетки и простого эксперимента TrEM.

Экспериментальная установка

Блок обработки жидкостей
Система обработки жидкости TED состоит из трех шприцевых приводных насосов («насосы 1 – 3»), каждый из которых оснащен поворотным клапаном(рисунок 1). Питание обеспечивают насосы 1 – 3 с напряжением 24 В постоянного тока. Связь с управляющим программным обеспечением (написанным на Visual Basic и C++) осуществляется через интерфейс RS232 для насоса 1. Команды распределяются через последовательные порты расширения ввода/вывода от насоса 1 до насосов 2-3. Насосы 1-3 оснащены стеклянными шприцами (шприцы 1-3′, здесь мы используем шприцы 250 мкл/нулевой объем мертвого объема). Каждый клапан имеет два положения: «загрузка» и «дозирование». Положение «нагрузка» используется для аспирации образца в шприц. Короткая деталь (~ 3 – 4 см) 1/16″ O.D., 0.01′′ I.D. FEP трубка соединена через фланцевые фитинги ETFE/ETFE с «нагрузочной» позицией клапанов 1-3. Этот короткий кусок трубки достигает резервуара для проб (обычно пластиковая трубка объемом 1,5 мл или 0,5 мл). Положение «дозировать» ведет к распылительной форсулке. Соединение между выходом «дозирования» и распылительным соплом производится полиэтиленовой трубкой (длина ~ 20-30 см, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), с коротким куском втулки трубки (~ 0,5 см) и фланцевыми фитингами ETFE / ETFE.

Пневматический плунжер
TED использует пневматический плунжер для ускорения сетки и перемещения ее через распыление образцов в контейнер с жидким этаном. Пинцет с отрицательным давлением удерживает сетку, ввинченную в самодельный держатель, который крепится к двухвостковому пневматическому цилиндру(рисунок 2А).

Давление подается из большого баллона с азотным газом (размер W), оснащенного многоступенчатым регулятором (0 – 10 бар, «основное давление»). Гибкая армированная трубка из ПВХ (12 мм O.D.) соединяет регулятор с 12-портовым коллектором, куда азот под давлением подается в сопло и пневматический плунжер. Поток газа через сопло постоянен, регулируется непосредственно в азотном баллоне (основное давление). Соединение с соплом выполнено с помощью pu трубок (4 мм O.D., 2.5 мм I.D.), короткого куска полиэтиленовой трубки (~ 8 см длины, 0,043″ O.D., 0.015″ I.D.) и соответствующих разъемов. Давление на пневматический плунжер контролируется через электромагнитный клапан. Pu трубка (4 мм O.D., 2.5 мм I.D.) соединяет электромагнитный клапан с регулятором и пневматическим плунжером, чтобы обеспечить снижение давления погружения (≤ основного давления). Электромагнитный клапан управляется компьютером. Схематический обзор установки приведен на рисунке 2B.

Обратите внимание, что при такой установке давление погружения всегда равно или меньше давления распыляемого газа (основного давления). Тем не менее, настройку можно легко изменить, включив второй регулятор перед распылительным соплом, чтобы обеспечить более высокие скорости погружения при низком давлении распыляемого газа. Высокое давление (>> 2 бар) может повредить распылительное сопло PDMS.

ВНИМАНИЕ: Это система под давлением, и «основное давление» всегда должно быть < 7 бар.

Давления от 0,5 до 2 бар обычно используются для пневматического плунжера и показывают приблизительно линейную зависимость между давлением и скоростью (в вертикальном положении распыления). Скорости погружения измеряются с помощью осциллографа, соединенного в линию с потенциометром скольжения (10 кОм) и параллельно с резистором 2 кОм(рисунок 2C). Блок питания обеспечивает потенциометр с напряжением 9 В постоянного тока. В то время как приблизительная скорость погружения устанавливается до эксперимента путем установки давления погружения, потенциометр дает точное считывание скорости после эксперимента.

Распылительные форсунок и контейнер для жидкого этана
Изготовление и эксплуатация газодинамических виртуальных сопел для доставки образцов на основе распыления подробно описаны в другом месте^15. Как описано выше, выпускные отверстия “дозирования” клапанов 1-3 соединены с жидкостными входами сопла(фиг.3А). Распыляемый газ под давлением подключается к входному отверстию сопла. Входы в распылительные сопла PDMS таковы, что трубки 0,043″ O.D. PE можно использовать напрямую без необходимости в фитингах. Наша конструкция сопла содержит геометрию «струйной в струе» для смешивания двух образцов, аналогичную устройству, описанному в ref.^18. Схема конструкции показана на рисунке 3В,микроскопическое изображение сопла показано на рисунке 3С. Компоновка микрофлюидного устройства требует использования трех шприцев для смешивания двух образцов. Распылительная форсунок обычно размещается на расстоянии 1-1,5 см от сетки (во время подачи образца).

Мы используем жидкий этан в качестве криогена, в контейнере с жидким этаном / азотом, как это используется для стандартного метода промокления. Вертикальное расположение чашки жидкого этана достигается с помощью лабораторной подъемной платформы.

Контроль распыления и среды сетки
Плунжер и распылительное сопло содержатся в изготовленной на заказ коробке из ПММА (акрилового стекла) с двойной дверцей(рисунок 4А). Высокая относительная влажность внутри коробки достигается системой увлажнения воздуха в задней части TED(рисунок 4B). Воздух подается насосом и подается в первую 10-дюймовую канистру (обычно используемую для очистки воды под раковиной). Канистра заполнена низким (~ 5-10 см) уровнем воды, а также вмещает увлажнитель воздуха. Сетевое питание увлажнителя контролируется цифровым регулятором влажности/температуры и датчиком влажности/температуры, расположенным внутри акрилового стеклянного ящика. Контроллер настроен на выключение насоса, когда относительная влажность достигает ≥ 90 %. Увлажненный воздух из первой канистры прокачивается через диффузор, погружается в воду во второй 10-дюймовой канистре, а затем поступает в коробку из акрилового стекла.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Поскольку образец аэрозолируется в распылительном сопле, опасные биологические или химические образцы не подходят в качестве образцов.

Последовательность выполнения
Кнопка Выполнить сценарий в управляют программном обеспечении инициирует последовательность выполнения. Эта последовательность команд может быть предварительно определена в файле скрипта и изменена с помощью программного обеспечения. Наиболее важные переменные объясняются здесь:

Скорость распыления: скорость распыления определяет расход жидкости, используемый шприцевым насосом. Расход можно рассчитать следующим образом: используемые здесь двигатели шприцевого насоса имеют фиксированный размер шага. Полный ассортимент насоса разделен на 48 000 ступеней. Вторым важным фактором является объем шприца. Обычно мы используем шприцы 250 мкл. Скорость распыления в управляемом программном обеспечении устанавливается как количество шагов в секунду. Скорость распыления 1000 шагов в секунду соответствует:

Объем распыления: Объем распыления определяет общий объем распыляемого. Таким образом, он также определяет продолжительность распыления. Объем распыления в управляемом программном обеспечении устанавливается в виде нескольких шагов. Объем распыления 2000 шагов при скорости распыления 1000 шагов в секунду приводит к продолжительности распыления 2 с и общему объему 10,4 мкл.

Время предварительного распыления: эта переменная определяет время между началом распыления и погружением. Важно выбрать время задержки таким образом, чтобы спрей успел стабилизироваться перед погружением сетки. Обычно спрей дают 1,5 – 4 с для стабилизации до погружения сетки. Распыление сохраняется до тех пор, пока сетка не пройдет. Обычно поток жидкости (и, следовательно, распыление) прекращается через 0,5-1 с после погружения сетки. Например, при использовании скорости распыления 1000 шагов / с и объема распыления 2000 шагов типичное время предварительного распыления составляет 1,5 с.

Примерная последовательность команд показана на рисунке 5А,положение сетки во времени показано на рисунке 5B.