Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

Hintergrund
Jüngste Entwicklungen in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Strukturstudien von immer komplexeren Systemen mit hoher Auflösung ermöglicht. Mit wenigen Ausnahmen beschränkten sich solche Studien auf biologische Makromoleküle im Gleichgewicht¹ oder relativ langsame Reaktionen². Viele Prozesse in vivo laufen auf einer schnelleren Zeitskala (Millisekunden) ab und es besteht ein zunehmendes Interesse an zeitaufgelöster Kryo-EM (TrEM) auf diesen Zeitskalen³. Die herkömmliche Kryo-EM-Probenvorbereitung durch die Blotting-Methode ist jedoch zu langsam für Millisekunden-TrEM.

Die Blotting-Methode hat neben der schlechten Zeitauflösung noch andere Einschränkungen. Proteine und Proteinkomplexe können unter Denaturierung oder bevorzugter Orientierung auf Gittern^{leiden 4}. Es hat sich gezeigt, dass die Verringerung der Expositionszeit gegenüber der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Probenvorbereitung die bevorzugte Orientierung und Proteindenaturierung verringert^5,6. So ermöglicht eine schnelle Netzvorbereitung nicht nur Millisekunden-TrEM, sondern kann auch die Netzqualität verbessern.

Derzeit gibt es drei verschiedene Ansätze zur automatisierten Netzvorbereitung. Der erste Ansatz verwendet einen Stift oder eine Kapillare, die eine kleine Menge an Probe enthält. Nach der Herstellung des Kontakts zwischen der Flüssigkeit und der Gitteroberfläche wird die Probe auf das Gitter^7,8“geschrieben”. Der Beispielantragsprozess ist relativ langsam und dauert einige Sekunden. Ein alternativer Ansatz verwendet die kontrollierte Tröpfchenerzeugung durch einen Piezospender und selbstableitende Gitter⁹. Dies ermöglicht schnellere Dosier- bis Gefrierzeiten, ist aber immer noch durch Tröpfchen- und Dochtgeschwindigkeit begrenzt (derzeit 54 ms). Der bisher schnellste Ansatz ist der direkte Sprühansatz, bei dem die Probe in einer Sprühdüse zerstäubt wird und sich die kleinen (~ 10 – 20 μm) und schnellen (> 5 m/s) Tröpfchen bei Kontakt mit dem Kryo-EM-Gitter ausbreiten. Das Probenspray kann auf verschiedene Arten wie Luftstrahlzerstäuber, oberflächenakustische Wellen oder Ultraschallbefeuchter^{10 , 11,12,13}erzeugt werden. Nach unserer Erfahrung ist die Eisdicke beim direkten Sprühansatz größer, aber das direkte Sprühen ermöglicht das Dosieren gefrieren < 10 ms.

Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie ein zeitaufgelöstes EM-Gerät (TED), das mit einer mikrofluidischen Sprühdüse ausgestattet ist, verwendet werden kann, um Gitter auf einer schnellen Zeitskala^{vorzubereiten 14,15}. Das Gerät wurde verwendet, um Gitter mit einer minimalen Verzögerungszeit von 6 ms zwischen Probenanwendung und Einfrieren vorzubereiten und zwei Proben schnell zu mischen und einzufrieren. Das Design des TED basiert auf einer Vorgängerversion¹⁶ und ähnelt anderen sprühbasierten zeitaufgelösten Kryo-EM-Geräten^17.

Zunächst werden die vier Hauptteile des TED-Setups beschrieben. Das Herzstück des TED ist die Liquid Handling Unit, die für die Probenabsaugung und -dosierung zuständig ist. Ein pneumatischer Kolben bewegt das Gitter durch das Spray in das flüssige Ethan. Die Erzeugung des Sprays erfolgt mit mikrofluidischen Sprühdüsen und das Einfrieren erfolgt in einem flüssigen Ethanbehälter, die kurz beschrieben werden. Schließlich werden die zusätzlichen Funktionen zur Steuerung der Netzumgebung, insbesondere der Luftfeuchtigkeit, hervorgehoben. Es folgen detaillierte Protokolle für den Betrieb des Gerätes und für die Durchführung von TrEM-Experimenten. Repräsentative Ergebnisse werden für eine schnelle Netzvorbereitung und ein einfaches TrEM-Experiment gegeben.

Versuchsaufbau

Die Liquid-Handling-Einheit
Das Liquid-Handling-System des TED besteht aus drei Spritzenantriebspumpen (“Pumpen 1 – 3”), die jeweils mit einer Zellenradschleuse ausgestattet sind (Abbildung 1). Ein Netzteil versorgt die Pumpen 1 – 3 mit 24 V DC. Die Kommunikation mit der Steuerungssoftware (geschrieben in Visual Basic und C++) erfolgt über eine RS232-Schnittstelle zu Pump 1. Die Befehle werden über die seriellen E/A-Erweiterungsports von Pumpe 1 bis Pumpen 2-3 verteilt. Die Pumpen 1-3 sind mit Glasspritzen ausgestattet (‘Spritzen 1-3’, wir verwenden hier 250 μL/Null Totvolumen spritzen). Jedes Ventil hat zwei Positionen, “Load” und “Dispense”. Die “Last”-Position wird verwendet, um die Probe in die Spritze abzusaugen. Ein kurzes Stück (~ 3 – 4 cm) aus 1/16″ O.D., 0,01′′ I.D. FEP-Schläuchen ist über ETFE/ETFE-Flansch-Verschlussstücke mit der “Last”-Position der Ventile 1-3 verbunden. Dieses kurze Stück Schlauch reicht in das Probenreservoir (typischerweise ein 1,5 ml oder 0,5 ml Kunststoffröhrchen). Die “Dispense”-Position führt zur Sprühdüse. Die Verbindung zwischen dem “Dispense”-Auslass und der Sprühdüse erfolgt durch PE-Schläuche (~ 20-30 cm Länge, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), mit einem kurzen Stück Hülsenschlauch (~ 0,5 cm) und ETFE/ETFE-Flansch-Fittings.

Der pneumatische Kolben
Der TED verwendet einen pneumatischen Kolben, um das Gitter zu beschleunigen und es durch das Probenspray in den flüssigen Ethanbehälter zu bewegen. Eine Unterdruckpinzette hält das Gitter, das in eine selbstgebaute Halterung geschraubt wird, die an einem Doppelstab-Pneumatikzylinder montiert ist (Abbildung 2A).

Der Druck wird von einer großen Stickstoffgasflasche (Größe W) geliefert, die mit einem mehrstufigen Regler (0 – 10 bar, “Hauptdruck”) ausgestattet ist. Flexibler verstärkter PVC-Schlauch (12 mm O.D.) verbindet den Regler mit einem 12-Port-Verteiler, in dem unter Druck stehender Stickstoff an die Düse und den pneumatischen Kolben abgegeben wird. Der Gasfluss durch die Düse ist konstant und wird direkt am Stickstoffzylinder geregelt (Hauptdruck). Die Verbindung zur Düse erfolgt mit PU-Schläuchen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), einem kurzen Stück PE-Schlauch (~ 8 cm Länge, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) und entsprechenden Anschlüssen. Der Druck auf den pneumatischen Kolben wird über ein Magnetventil gesteuert. PU-Schläuche (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden das Magnetventil mit einem Regler und dem pneumatischen Kolben, um einen reduzierten Tauchdruck (≤ Hauptdruck) zu ermöglichen. Das Magnetventil ist computergesteuert. Eine schematische Übersicht über das Setup finden Sie in Abbildung 2B.

Beachten Sie, dass bei diesem Setup der Tauchdruck immer gleich oder kleiner als der Sprühgasdruck (Hauptdruck) ist. Das Setup kann jedoch leicht geändert werden, indem ein zweiter Regler vor der Sprühdüse integriert wird, um höhere Tauchgeschwindigkeiten bei niedrigem Sprühgasdruck zu ermöglichen. Hohe Drücke (>> 2 bar) können die PDMS-Sprühdüse beschädigen.

ACHTUNG: Dies ist ein Drucksystem und der “Hauptdruck” sollte immer < 7 bar betragen.

Für den pneumatischen Kolben werden typischerweise Drücke zwischen 0,5 und 2 bar verwendet und zeigen ein annähernd lineares Verhältnis zwischen Druck und Geschwindigkeit (an der vertikalen Position des Sprays). Tauchgeschwindigkeiten werden mit einem Oszilloskop gemessen, das mit einem Schiebepotentiometer (10 kΩ) und parallel mit einem 2 kΩ-Widerstand verbunden ist(Abbildung 2C). Ein Netzteil versorgt das Potentiometer mit 9 V DC. Während die ungefähre Tauchgeschwindigkeit vor dem Experiment durch Einstellen des Tauchdrucks eingestellt wird, liefert das Potentiometer eine genaue Ablesung der Geschwindigkeit nach dem Experiment.

Sprühdüsen und Flüssigethanbehälter
Die Herstellung und der Betrieb gasdynamischer virtueller Düsen für die sprühbasierte Probenabgabe wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben¹⁵. Wie oben beschrieben, sind die “Dosierauslässe” der Ventile 1-3 mit den Flüssigkeitseinlässen der Düse verbunden (Abbildung 3A). Das unter Druck stehende Sprühgas wird mit dem Gaseinlass der Düse verbunden. Die Einlässe in den PDMS-Sprühdüsen sind so, dass 0,043″ O.D. PE-Schläuche direkt ohne Armaturen verwendet werden können. Unser Düsendesign enthält eine “Jet-in-Jet”-Geometrie zum Mischen von zwei Proben, ähnlich der in Referenz 18 beschriebenen^Vorrichtung. Ein Schema des Designs ist in Abbildung 3Bdargestellt, ein mikroskopisches Bild einer Düse ist in Abbildung 3Cdargestellt. Das Layout des mikrofluidischen Geräts erfordert die Verwendung von drei Spritzen, um zwei Proben zu mischen. Die Sprühdüse wird typischerweise in 1-1,5 cm Abstand vom Gitter positioniert (während der Probenanwendung).

Wir verwenden flüssiges Ethan als Kryogen in einem flüssigen Ethan/ Stickstoffbehälter, wie es für die Standard-Blotting-Methode verwendet wird. Die vertikale Positionierung des flüssigen Ethanbechers wird mit einer Laborhebebühne erreicht.

Steuerung der Sprüh- und Gitterumgebung
Der Kolben und die Sprühdüse sind in einer speziell angefertigten PMMA-Box (Acrylglas) mit einer Doppeltür enthalten (Abbildung 4A). Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit im Inneren der Box wird durch ein Luftbefeuchtungssystem an der Rückseite des TED erreicht (Abbildung 4B). Die Luft wird von einer Pumpe zugeführt und in einen ersten 10-Zoll-Kanister (typischerweise für die Reinigung von Wasser unter der Spüle verwendet) eingespeist. Der Kanister ist mit einem niedrigen Wasserstand (~ 5-10 cm) gefüllt und beherbergt auch eine Luftbefeuchtereinheit. Die Stromversorgung des Luftbefeuchters wird über einen digitalen Feuchtigkeits-/Temperaturregler und einen Feuchtigkeits-/Temperatursensor im Inneren der Acrylglasbox gesteuert. Der Regler ist so eingestellt, dass die Pumpe ausgeschaltet wird, wenn die relative Luftfeuchtigkeit ≥ 90 % erreicht. Befeuchtete Luft aus dem ersten Kanister wird durch einen Diffusor gepumpt, in einem zweiten 10-Zoll-Kanister in Wasser getaucht und gelangt dann in den Acrylglaskasten.

ACHTUNG: Da die Probe in der Sprühdüse aerosolisiert wird, sind gefährliche biologische oder chemische Proben nicht als Proben geeignet.

Die Laufsequenz
Die Schaltfläche Skript ausführen in der Steuerungssoftware initiiert die Ausführungssequenz. Diese Befehlsfolge kann in einer Skriptdatei vordefiniert und durch die Software verändert werden. Die wichtigsten Variablen werden hier erklärt:

Sprühgeschwindigkeit: Die Sprühgeschwindigkeit bestimmt den Flüssigkeitsdurchfluss, der von der Spritzenpumpe verwendet wird. Der Durchfluss kann wie folgt berechnet werden: Die hier eingesetzten Spritzenpumpenmotoren haben eine feste Schrittgröße. Die gesamte Palette der Pumpe ist in 48.000 Schritte unterteilt. Der zweite wichtige Faktor ist das Spritzenvolumen. Wir verwenden typischerweise 250 μL Spritzen. Die Sprühgeschwindigkeit in der Steuerungssoftware wird als Anzahl der Schritte/Sekunde eingestellt. Eine Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde entspricht:

Sprühvolumen: Das Sprühvolumen bestimmt das zu sprühene Gesamtvolumen. Somit bestimmt es auch die Dauer des Sprays. Die Sprühmenge in der Steuerungssoftware wird in mehreren Schritten eingestellt. Ein Sprühvolumen von 2000 Schritten, bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde, führt zu einer Sprühdauer von 2 s und einem Gesamtvolumen von 10,4 μL.

Vorsprühzeit: Diese Variable definiert die Zeit zwischen dem Beginn des Sprays und dem Eintauchen. Es ist wichtig, die Verzögerungszeit so zu wählen, dass das Spray genügend Zeit hat, sich zu stabilisieren, bevor es das Gitter eintaucht. Normalerweise wird dem Spray 1,5 – 4 s gegeben, um sich zu stabilisieren, bevor das Gitter eingetaucht wird. Das Spray wird so lange aufrechterhalten, bis sich das Gitter durchbewegt hat. Normalerweise wird der Flüssigkeitsfluss (und damit das Spray) 0,5 bis 1 s gestoppt, nachdem das Gitter eingetaucht wurde. Bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/s und einem Sprühvolumen von 2000 Schritten beträgt eine typische Vorsprühzeit beispielsweise 1,5 s.

Eine beispielhafte Abfolge von Befehlen ist in Abbildung 5Adargestellt, die Rasterposition über die Zeit ist in Abbildung 5Bdargestellt.