Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

O tecido adiposo branco (TAB) representa o principal local de armazenamento de energia em mamíferos. Dentro desse tecido, os adipócitos, ou “células de gordura”, armazenam o excesso de calorias na forma de triglicerídeos, embalados em grandes gotículas lipídicas uniloculares. Além disso, os adipócitos secretam uma infinidade de fatores que regulam vários aspectos da homeostase energética ^1,2,3. Os adipócitos constituem a maior parte do volume de TAB; no entanto, os adipócitos representam apenas menos de 50% do total de células encontradas no WAT ^4,5. O compartimento não adipócitos do TAB, ou fração estromal-vascular (SVF), é bastante heterogêneo e contém células endoteliais vasculares, células imunes residentes em tecidos, fibroblastos e populações de células precursoras de adipócitos (APC).

O WAT é excepcional em sua notável capacidade de expandir em tamanho à medida que a demanda por armazenamento de energia aumenta. A manutenção dessa plasticidade tecidual é essencial, pois o armazenamento adequado de lipídios no WAT protege contra a deposição de lipídios ectópicos deletérios em tecidos não adiposos⁶. A maneira pela qual os depósitos individuais de WAT sofrem essa expansão em resposta ao excesso calórico é um determinante crítico da sensibilidade à insulina no cenário de obesidade⁷. A expansão patológica do TAB, observada em indivíduos obesos com síndrome metabólica, é caracterizada pela expansão preferencial dos depósitos viscerais do TAB em detrimento do tecido adiposo subcutâneo metabolicamente favorável. Além disso, a resistência à insulina na obesidade está associada ao remodelamento patológico do TAB. Caracteriza-se por crescimento hipertrófico dos adipócitos existentes (aumento de tamanho), angiogênese inadequada, inflamação metabólica crônica, acúmulo de componentes da matriz extracelular (fibrose) e hipóxia tecidual ^8,9. Esses fenótipos de obesidade WAT estão associados à esteatose hepática e resistência à insulina, semelhante ao que é observado na condição de lipodistrofia (ausência de WAT funcional). Em contraste, a expansão saudável do WAT é observada na população obesa metabolicamente saudável e é caracterizada pela expansão preferencial do WAT subcutâneo protetor e expansão do depósito através da hiperplasia dos adipócitos¹⁰. O recrutamento de novos adipócitos é mediado pela diferenciação de adipócitos de novo de células precursoras de adipócitos (APCs) (denominada “adipogênese”). A hiperplasia de adipócitos coincide com graus relativamente mais baixos de fibrose WAT e inflamação metabólica ^6,11. Uma infinidade de tipos de células dentro do microambiente WAT influencia diretamente a saúde e a capacidade de expansão do WAT na obesidade¹². Como tal, definir a função dos vários tipos de células presentes no WAT continua sendo uma alta prioridade para o campo.

Na última década, várias estratégias foram empregadas para definir e isolar APCs nativos de WAT SVF¹³ humano e de camundongo. Tais estratégias isolam APCs com base na expressão da superfície celular de marcadores comuns de células-tronco/progenitoras mesenquimais usando técnicas de separação celular baseadas em anticorpos. Essas abordagens incluem classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), usando anticorpos marcados com fluoróforo, ou separação de esferas imunomagnéticas (ou seja, anticorpos quimicamente modificados). As proteínas de superfície celular direcionadas para o isolamento de APCs incluem PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Essas abordagens ajudaram a enriquecer os APCs; no entanto, as populações de células isoladas com base nesses marcadores são bastante heterogêneas. Estudos muito recentes de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) destacaram a heterogeneidade molecular e funcional das células estromais dentro da fração estromal-vascular isolada (SVF) do WAT murino 14,15,16,17. A partir de nosso próprio scRNA-seq e análises funcionais, identificamos e caracterizamos subpopulações de células perivasculares PDGFRβ+ imunomoduladoras e adipogênicas funcionalmente distintas no compartimento estromal do WAT intra-abdominal em camundongos adultos¹⁵. Os precursores fibroinflamatórios, ou FIPs, representam uma subpopulação proeminente de células PDGFRβ+ e podem ser isolados com base na expressão de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. As PIF carecem de capacidade adipogênica, exercem forte resposta pró-inflamatória a vários estímulos, produzem colágeno e secretam fatores antiadipogênicos¹⁵. A atividade pró-inflamatória e fibrogênica dessas células aumenta em associação com a obesidade em camundongos, implicando essas células como reguladoras do remodelamento do WAT. A subpopulação LY6C- CD9- PDGFRβ+ representa células precursoras de adipócitos (APCs). Essas APCs são enriquecidas na expressão de Pparg e outros genes pró-adipogênicos e prontamente se diferenciam em adipócitos maduros in vitro e in vivo¹⁵. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento dessas populações de células distintas de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos usando FACS e separação de esferas imunomagnéticas com anticorpos biotinilados. Este protocolo pode ser usado para isolar subpopulações progenitoras adiposas funcionalmente distintas de vários depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos machos e fêmeas adultos¹⁵. Estudar essas populações de células funcionalmente distintas isoladamente pode contribuir muito para nossa compreensão atual dos mecanismos moleculares que regulam a adipogênese e a remodelação do tecido adiposo intra-abdominal na saúde e na doença.

O protocolo abaixo detalha o isolamento de progenitores adiposos do WAT epididimal murino; no entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para isolar as células correspondentes dos depósitos de WAT mesentérico e retroperitoneal de camundongos machos e fêmeas¹⁵. Um protocolo detalhado sobre como identificar e isolar esses depósitos em camundongos pode ser encontrado em Bagchi et ^al.18. Este protocolo foi otimizado para o uso de camundongos de 6 a 8 semanas de idade. A frequência e a capacidade de diferenciação das APCs podem diminuir em associação com o envelhecimento.