Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Weißes Fettgewebe (WAT) stellt die Hauptstelle für die Energiespeicherung bei Säugetieren dar. In diesem Gewebe speichern Adipozyten oder “Fettzellen” überschüssige Kalorien in Form von Triglyceriden, die in großen unilokulären Lipidtröpfchen verpackt sind. Darüber hinaus sezernieren Adipozyten eine Vielzahl von Faktoren, die verschiedene Aspekte der Energiehomöostase regulieren ^1,2,3. Adipozyten machen den Großteil des WAT-Volumens aus; Adipozyten machen jedoch nur weniger als 50 % der Gesamtzellen aus, die in WAT ^4,5 gefunden werden. Das nicht-adipozyten-Kompartiment der WAT oder stromal-vaskulären Fraktion (SVF) ist recht heterogen und enthält vaskuläre Endothelzellen, geweberesidente Immunzellen, Fibroblasten und Adipozyten-Vorläuferzellpopulationen (APC).

WAT ist außergewöhnlich in seiner bemerkenswerten Fähigkeit, mit steigender Nachfrage nach Energiespeichern zu expandieren. Die Aufrechterhaltung dieser Gewebeplastizität ist von entscheidender Bedeutung, da eine angemessene Speicherung von Lipiden in WAT vor schädlicher ektopischer Lipidablagerung in Nicht-Fettgewebe schützt⁶. Die Art und Weise, wie die einzelnen WAT-Depots diese Expansion als Reaktion auf einen Kalorienüberschuss erfahren, ist eine kritische Determinante für die Insulinsensitivität bei Fettleibigkeit⁷. Die pathologische WAT-Expansion, die bei adipösen Personen mit metabolischem Syndrom beobachtet wird, ist durch eine bevorzugte Expansion der viszeralen WAT-Depots auf Kosten des metabolisch günstigen subkutanen Fettgewebes gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die Insulinresistenz bei Adipositas mit einem pathologischen Umbau der WAT verbunden. Dies ist gekennzeichnet durch hypertrophes Wachstum der vorhandenen Adipozyten (Vergrößerung), unzureichende Angiogenese, chronische metabolische Entzündung, Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten (Fibrose) und Gewebehypoxie ^8,9. Diese WAT-Phänotypen der Adipositas sind mit Lebersteatose und Insulinresistenz verbunden, ähnlich wie bei der Lipodystrophie (Fehlen einer funktionellen WAT). Im Gegensatz dazu wird eine gesunde WAT-Expansion in der metabolisch gesunden adipösen Population beobachtet und ist durch eine bevorzugte Expansion der protektiven subkutanen WAT und eine Depotexpansion durch Adipozytenhyperplasie gekennzeichnet¹⁰. Die Rekrutierung neuer Adipozyten wird durch die De-novo-Differenzierung von Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) (als “Adipogenese” bezeichnet) vermittelt. Die Adipozytenhyperplasie fällt mit einem relativ niedrigeren Grad der WAT-Fibrose und der metabolischen Entzündung zusammen ^6,11. Eine Vielzahl von Zelltypen innerhalb der WAT-Mikroumgebung beeinflussen direkt die Gesundheit und Erweiterbarkeit von WAT bei Adipositas¹². Daher hat die Definition der Funktion der verschiedenen Zelltypen, die in WAT vorhanden sind, nach wie vor eine hohe Priorität für das Feld.

In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um native APCs aus Mensch und Maus zu definieren und zu isolieren WAT^{SVF 13}. Bei solchen Strategien werden APCs basierend auf der Zelloberflächenexpression gemeinsamer mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellmarker unter Verwendung von Antikörper-basierten Zelltrennungstechniken isoliert. Zu diesen Ansätzen gehören die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit fluorophormarkierten Antikörpern oder die immunomagnetische Bead-Trennung (d. h. chemisch modifizierte Antikörper). Zu den Zelloberflächenproteinen, die für die Isolierung von APCs vorgesehen sind, gehören PDGFRα, PDGFRβ, CD34 und SCA-1. Diese Ansätze haben dazu beigetragen, APCs zu bereichern; Die Zellpopulationen, die auf der Grundlage dieser Marker isoliert werden, sind jedoch recht heterogen. Jüngste Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) haben die molekulare und funktionelle Heterogenität von Stromazellen innerhalb der isolierten stromal-vaskulären Fraktion (SVF) der murinen WAT 14,15,16,17 hervorgehoben. Aus unseren eigenen scRNA-seq- und funktionellen Analysen haben wir funktionell unterschiedliche immunmodulierende und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen im stromalen Kompartiment von intraabdominalen WAT bei adulten Mäusen identifiziert und charakterisiert¹⁵. Fibroinflammatorische Vorläufer (FIPs) stellen eine prominente Subpopulation von PDGFRβ+-Zellen dar und können auf der Grundlage der LY6C-Expression (LY6C+ PDGFRβ+-Zellen) isoliert ^werden15. FIPs fehlt es an adipogener Kapazität, sie üben eine starke entzündungsfördernde Reaktion auf verschiedene Reize aus, produzieren Kollagen und sezernieren anti-adipogene Faktoren¹⁵. Die proinflammatorische und fibrogene Aktivität dieser Zellen nimmt in Verbindung mit Fettleibigkeit bei Mäusen zu, was diese Zellen als Regulatoren des WAT-Umbaus impliziert. Die LY6C-CD9-PDGFRβ+-Subpopulation repräsentiert Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs). Diese APCs sind in der Expression von Pparg und anderen pro-adipogenen Genen angereichert und differenzieren sich in vitro und in vivo leicht zu reifen^{Adipozyten 15}. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung dieser unterschiedlichen Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse unter Verwendung von FACS und die immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern zur Verfügung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um funktionell unterschiedliche Fettvorläufer-Subpopulationen aus mehreren intraabdominalen WAT-Depots von adulten männlichen und weiblichen Mäusen zu isolieren¹⁵. Die isolierte Untersuchung dieser funktionell unterschiedlichen Zellpopulationen kann wesentlich zu unserem aktuellen Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, die die Adipogenese und den Umbau des intraabdominalen Fettgewebes bei Gesundheit und Krankheit regulieren.

Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von adipösen Vorläuferzellen aus murinen Nebenhoden-WAT; Das gleiche Verfahren kann jedoch verwendet werden, um entsprechende Zellen aus dem mesenterialen und retroperitonealen WAT-Depot sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse zu isolieren¹⁵. Ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung und Isolierung dieser Depots bei Mäusen findet sich in Bagchi et ^al.18. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung von Mäusen im Alter von 6-8 Wochen optimiert. Die Häufigkeit und Differenzierungsfähigkeit von APCs kann im Zusammenhang mit dem Altern abnehmen.