Выделение субпопуляций адипогенных и фибровоспалительных стромальных клеток из внутрибрюшных жировых депо мышей

Белая жировая ткань (WAT) является основным местом хранения энергии у млекопитающих. В этой ткани адипоциты, или «жировые клетки», хранят избыточные калории в виде триглицеридов, упакованных в большие однокамерные липидные капли. Кроме того, адипоциты выделяют множество факторов, которые регулируют различные аспекты энергетического гомеостаза ^1,2,3. Адипоциты составляют основную часть объема ВАТ; однако адипоциты составляют менее 50% от общего числа клеток, обнаруженных в WAT ^4,5. Неадипоцитарный компартмент WAT, или стромально-васкулярная фракция (SVF), довольно гетероген и содержит сосудистые эндотелиальные клетки, тканевые резидентные иммунные клетки, фибробласты и популяции клеток-предшественников адипоцитов (APC).

WAT исключительна своей замечательной способностью расширяться в размерах по мере роста спроса на хранение энергии. Поддержание этой пластичности тканей имеет важное значение, поскольку адекватное хранение липидов в WAT защищает от вредного эктопического отложения липидов в нежировых тканях⁶. Способ, которым отдельные депо WAT претерпевают это расширение в ответ на избыток калорий, является критическим фактором, определяющим чувствительность к инсулину в условиях ожирения^. Патологическое расширение ВАТ, наблюдаемое у лиц с ожирением и метаболическим синдромом, характеризуется преимущественным расширением висцеральных депо ВАТ за счет метаболически благоприятной подкожной жировой ткани. Кроме того, инсулинорезистентность при ожирении связана с патологическим ремоделированием ВАТ. Это характеризуется гипертрофическим ростом имеющихся адипоцитов (увеличением в размерах), недостаточным ангиогенезом, хроническим метаболическим воспалением, накоплением компонентов внеклеточного матрикса (фиброзом) и гипоксией тканей ^8,9. Эти WAT-фенотипы ожирения связаны со стеатозом печени и инсулинорезистентностью, аналогично тому, что наблюдается при липодистрофии (отсутствии функциональной WAT). Напротив, здоровое расширение WAT наблюдается в метаболически здоровой популяции с ожирением и характеризуется преимущественным расширением защитного подкожного WAT и расширением депо через гиперплазию адипоцитов¹⁰. Рекрутирование новых адипоцитов опосредовано дифференцировкой адипоцитов de novo из клеток-предшественников адипоцитов (APC) (так называемая «адипогенез»). Гиперплазия адипоцитов совпадает с относительно более низкими степенями фиброза WAT и метаболического воспаления ^6,11. Множество типов клеток в микроокружении WAT напрямую влияют на здоровье и расширяемость WAT при ожирении¹². Таким образом, определение функций различных типов клеток, присутствующих в WAT, остается высокоприоритетным для данной области.

За последнее десятилетие было использовано несколько стратегий для определения и изоляции нативных APC от WAT SVF¹³ человека и мыши. Такие стратегии выделяют АПК на основе экспрессии на клеточной поверхности общих мезенхимальных маркеров стволовых/прогениторных клеток с использованием методов разделения клеток на основе антител. Эти подходы включают флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) с использованием антител, меченных флуорофорами, или иммуномагнитное разделение шариков (т.е. химически модифицированные антитела). Белки клеточной поверхности, предназначенные для выделения APC, включают PDGFRα, PDGFRβ, CD34 и SCA-1. Эти подходы помогли обогатить APC; Однако клеточные популяции, выделенные на основе этих маркеров, достаточно неоднородны. Совсем недавние исследования секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) выявили молекулярную и функциональную гетерогенность стромальных клеток в пределах изолированной стромально-васкулярной фракции (SVF) мышиного WAT 14,15,16,17. С помощью нашего собственного scRNA-seq и функционального анализа мы идентифицировали и охарактеризовали функционально различные иммуномодулирующие и адипогенные субпопуляции периваскулярных клеток PDGFRβ+ в стромальном компартменте внутрибрюшной WAT у взрослых мышей¹⁵. Фибровоспалительные предшественники, или FIP, представляют собой заметную субпопуляцию PDGFRβ+ клеток и могут быть выделены на основе экспрессии LY6C (LY6C+ PDGFRβ+ клеток)¹⁵. ФИП обладают адипогенной способностью, оказывают сильное провоспалительное реагирование на различные раздражители, продуцируют коллаген и секретируют антиадипогенные факторы¹⁵. Провоспалительная и фиброгенная активность этих клеток увеличивается в связи с ожирением у мышей, что делает эти клетки регуляторами ремоделирования ВАТ. Субпопуляция LY6C-CD9-PDGFRβ+ представляет собой клетки-предшественники адипоцитов (APC). Эти APC обогащены экспрессией Pparg и других проадипогенных генов и легко дифференцируются в зрелые адипоциты in vitro и in vivo¹⁵. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выделения этих отдельных клеточных популяций из внутрибрюшных депо WAT взрослых мышей с использованием FACS и отделения иммуномагнитных гранул с биотинилированными антителами. Этот протокол может быть использован для выделения функционально различных субпопуляций жировых предшественников из множественных внутрибрюшных депо WAT взрослых самцов и самок мышей¹⁵. Изучение этих функционально различных клеточных популяций по отдельности может внести большой вклад в наше текущее понимание молекулярных механизмов, которые регулируют адипогенез и ремоделирование внутрибрюшной жировой ткани в здоровом и больном состоянии.

В приведенном ниже протоколе подробно описано выделение жировых предшественников из придатка яичка матки мышей; однако та же процедура может быть использована для выделения соответствующих клеток из брыжеечных и забрюшинных депо WAT как самцов, так и самок мышей¹⁵. Подробный протокол о том, как идентифицировать и изолировать эти депо у мышей, можно найти в Bagchi et ^al.18. Этот протокол был оптимизирован для использования мышами в возрасте 6-8 недель. Частота и дифференцировочная способность АПК могут снижаться в связи со старением.