細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価
Summary
このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。
Abstract
細胞内酸化/還元バランスを測定すると、生物の生理学的および/または病的な生理学的なレドックスの状態の概要を提供します。チオールは、ジチオールと酸化ジスルフィド比を使用して細胞の酸化還元状態を照らすのに特に重要です。設計されたシステイン含有蛍光タンパク質は、レドックス感受性バイオセンサーの新しい時代を開きます。そのうちの一つは、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質(roGFP)を、アデノウイルス伝達を伴う細胞に容易に導入することができ、細胞内のレドックス状態を細胞内プロセスを中断させることなく評価することができる。roGFPの減少したシステインおよび酸化シスチンは、それぞれ488nmおよび405nmで励起最大量を有し、525nmで発光する。これらの還元および酸化形態の比率を評価することで、細胞内の酸化還元バランスの計算が便利になります。この方法記事では、ヒト三重陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)を使用して、生細胞内の酸化還元状態を評価した。プロトコルステップには、細胞細胞群roGFPを発現させるアデノウイルスによるMDA-MB-231細胞株の伝達、H2O2による治療、2およびフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両方を用いたシステインおよびシスチン比の評価が含まれる。
Introduction
酸化ストレスは、1985年にヘルムート・シーズによって「前者に有利なプロキシダント抗酸化バランスの乱れ」として定義され、多くの研究が行われ、生物1、2、32,の疾患、栄養、および老化特異的な酸化還元状態を得1るために多くの研究が行われている。3それ以来、酸化ストレスの理解はより広がっています。病気や老化に対して抗酸化物質を使用する仮説をテストすると、酸化ストレスが害を引き起こすだけでなく、細胞内の他の役割も持っていることを示しています。さらに、科学者たちは、フリーラジカルがシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを示している。これらの研究のすべては、高分子の還元酸化(酸化還元)比の変化を決定することの重要性を強化します。酵素活性、酸化防止剤、酸化産物、酸化生成物は、様々な方法で評価することができます。これらの中で、チオール酸化を決定する方法は、細胞内の抗酸化物質とプロオキシド物質のバランス、ならびに生物4とのバランスについて報告するので、間違いなく最も使用されている。具体的には、グルタチオン(GSH)/グルタチオンジスルフィド(GSSG)および/またはシステイン(CyS)/シスチン(CySS)との比率が、生物の酸化還元状態をモニタリングするためのバイオマーカーとして使用される2。
プロオキシド剤と抗酸化物質のバランスをアッセリングするために使用される方法は、主に還元/酸化タンパク質または細胞内の小分子のレベルに依存します。ウェスタンブロットおよび質量分析は、還元/酸化された高分子(タンパク質、脂質など)の比率を広く評価するために使用され、GSH/GSSG比は分光光度測定5で評価することができる。これらの方法の一般的な特徴は、細胞のリシスおよび/または組織均質化によるシステムの物理的摂動である。これらの分析は、異なる細胞コンパートメントの酸化状態を測定する必要がある場合にも困難になります。これらの摂動はすべてアッセイ環境で人工物を引き起こす。
レドックス感受性蛍光タンパク質は、細胞内の妨害を引き起こすことなく酸化還元バランスを評価するための有利な時代を開いた6.それらは異なる細胞内区画を標的とすることができ、細胞小器官間のクロストークを調査するためにコンパートメント特有の活動(例えば、ミトコンドリアとサイトゾルのレドックス状態をアッサイル)の定量化を可能にする。黄色蛍光タンパク質(YFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HyPeRタンパク質が、マイヤーと同グループの研究グループによってレビューされる。これらのタンパク質の中で、酸化還元感受性GFP(roGFP)は、そのCyS(例えば488 nm/em.525 nm)およびCySS(例えば405 nm/525 nm)残基の異なる蛍光読み出しに起因するユニークであり、YFP77、88などの他のレドックス感受性タンパク質とは異なり、比量分析を可能にする。レシオメトリック出力は、式レベル、検出感度、およびフォトブリーチ8の差を相殺するので、価値があります。細胞の細胞内区画(細胞ゾル、ミトコンドリア、核)または異なる生物(細菌ならびに哺乳類細胞)は、roGFP7、9、109,を修飾7することによって標的とすることができる。10
roGFPアッセイは、特にリアルタイム可視化実験のために、蛍光イメージング技術を用いて行われる。また、所定の時間ポイントを用いた実験では、roGPSのフローサイトメトリック解析も可能です。現在の記事では、アデノウイルス伝達を介してroGFP(細胞質を標的とする)を過剰発現する哺乳類細胞におけるレドックス状態の比率評価を行う蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーの両方について説明しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物におけるチオール/ジスルフィドバランスは、細胞の酸化還元状態を反映する。生物はグルタチオン、システイン、プロテインチオール、低分子チオールを有し、そのすべてが細胞4の酸化レベルに影響され、酸化状態をエコーする。工学的roGFPはCyS残基7を介してチオール/ジスルフィドバランスの無停止定量化を可能にする。roGFPのレシオメトリック特?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
細胞内の細胞ゾル特異的roGFPを発現するための構築および組換えアデノウイルスは、それぞれポール・T・シューマッカー博士、フライベルク医学部、ノースウェスタン大学、ViraQuest Inc.の研究室で生成された。この研究は、NIH国立一般医学研究所生物医学研究優秀センター(COBRE NIGMS)、国立総合医療科学システム薬理学および毒物学トレーニングプログラム助成金T32 GM106999を通じて、がん治療に対する宿主反応研究センターが支援しました。 UAMS財団/医学研究基金賞AWD00053956、UAMS年末首相賞AWD00053484。フローサイトメトリーコア施設は、微生物病態および宿主炎症反応センターがCOBRE NIGMSを通じてP20GM103625を付与することによって部分的に支えられた。コンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。ATAはトルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2214-A奨学金によって支援されました。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
Referencias
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