Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten
Summary
Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.
Abstract
Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio’s. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H2O2, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.
Introduction
Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als “een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste”1, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat vrije radicalen een belangrijke rol spelen bij signaaltransductie2. Al deze studies versterken het belang van het bepalen van de veranderingen in de reductie-oxidatie (redox) verhouding van macromoleculen. Enzymactiviteit, antioxidanten en/of oxidanten en oxidatieproducten kunnen met verschillende methoden worden beoordeeld. Onder deze, methoden die thiol oxidatie te bepalen zijn misschien wel de meest gebruikte omdat ze rapporteren over de balans tussen antioxidanten en prooxidanten in cellen, evenals organismen4. Specifiek worden verhoudingen tussen glutathion (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) en/of cysteïne (CyS)/cystine (CySS) gebruikt als biomarkers voor het monitoren van de redoxstatus van organismen2.
Methoden die worden gebruikt voor het testen van de balans tussen prooxidanten en antioxidanten zijn voornamelijk afhankelijk van de niveaus van verminderde / geoxideerde eiwitten of kleine moleculen in cellen. Westerse vlekken en massaspectrometrie worden gebruikt om de verhoudingen van verminderde/geoxideerde macromoleculen (eiwit, lipiden enz.) breed te beoordelen, en GSH/GSSG-verhoudingen kunnen worden beoordeeld met spectrofotometrie5. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze methoden is de fysieke verstoring van het systeem door cellyse en/of weefselhomogenisatie. Deze analyses worden ook uitdagend wanneer het nodig is om de oxidatiestatus van verschillende cellulaire compartimenten te meten. Al deze verstoringen veroorzaken artefacten in de testomgeving.
Redox-gevoelige fluorescerende eiwitten openden een gunstig tijdperk voor het evalueren van de redoxbalans zonder een verstoring in de cellen6te veroorzaken. Ze kunnen zich richten op verschillende intracellulaire compartimenten, waardoor de kwantificering van compartimentspecifieke activiteiten (bijvoorbeeld de redoxtoestand van mitochondriën en de cytosol) kan worden geflankeerd om kruisspraak tussen cellulaire organellen te onderzoeken. Geel fluorescerend eiwit (YFP), groen fluorescerend eiwit (GFP) en HyPeR-eiwitten worden beoordeeld door Meyer en collega’s6. Onder deze eiwitten is redox-gevoelige GFP (roGFP) uniek vanwege verschillende fluorescerende uitlezingen van zijn CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) en CySS (ex. 405 nm/525 nm) residuen, waardoor ratiometrische analyse mogelijk is, in tegenstelling tot andere redoxgevoelige eiwitten zoals YFP7,8. Ratiometrische output is waardevol omdat het een tegenwicht biedt aan de verschillen tussen expressieniveaus, detectiegevoeligheden en photobleaching8. Subcellulaire compartimenten van cellen (cytosol, mitochondriën, kern) of verschillende organismen (bacteriën en zoogdiercellen) kunnen worden gericht door roGFP7,9,10te wijzigen .
roGFP-testen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende beeldvormingstechnieken, vooral voor real-time visualisatie-experimenten. Flow cytometrische analyses van roGFP’s zijn ook mogelijk voor experimenten met vooraf bepaalde tijdstippen. Het huidige artikel beschrijft zowel het gebruik van fluorescerende microscopie als stroomcytometrie om een ratiometrische beoordeling van de redox-toestand in zoogdiercellen uit te voeren die roGFP (gericht op cytosol) via adenovirale transductie overpreiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen4. Engineered roGFP’s maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen7. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen vo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De construct en recombinant adenovirus voor het uitdrukken van cytosol-specifieke roGFP in cellen werden gegenereerd in het laboratorium van Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, en ViraQuest Inc, respectievelijk. Deze studie werd ondersteund door het Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 via het NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor’s Awards AWD00053484. De flow cytometry core faciliteit werd gedeeltelijk ondersteund door het Center for Microbial Pathogenese en Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 via de COBRE NIGMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het NIH. ATA werd ondersteund door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TUBITAK) 2214-A beurs.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
Referencias
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O’Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
