Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host
Summary
La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L’articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l’effetto innesto contro leucemia.
Abstract
Il trapianto di midollo osseo allogenico (BMT) è una terapia efficace per le neoplasie ematologiche dovute all’effetto innesto-contro leucemia (GVL) per sradicare i tumori. Tuttavia, la sua applicazione è limitata dallo sviluppo della malattia innesto-contro-ospite (GVHD), una complicazione importante di BMT. Il GVHD viene evocato quando le cellule T negli innesti del donatore riconosconoalloantigeno espresso dalle cellule riceventi e montano attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti sani riceventi. Così, le terapie tradizionali sono progettate per sopprimere l’allocazione delle cellule T del donatore. Tuttavia, questi approcci compromettono sostanzialmente l’effetto GVL in modo che la sopravvivenza del destinatario non sia migliorata. Comprendere gli effetti degli approcci terapeutici su BMT, GVL e GVHD, è quindi essenziale. A causa delle capacità di presentazione dell’antigene e di citochina per stimolare le cellule T del donatore, le cellule dendritiche dei donatori (DC) svolgono un ruolo significativo nell’induzione del GVHD. Pertanto, l’indirizzamento dei controller di dominio destinatario diventa un potenziale approccio per il controllo di GVHD. Questo lavoro fornisce una descrizione di una nuova piattaforma BMT per studiare come i DC host regolano le risposte GVH e GVL dopo il trapianto. È inoltre stato presentato un modello BMT efficace per studiare la biologia del GVHD e della GVL dopo il trapianto.
Introduction
Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeneiche (BMT) è una terapia efficace per il trattamento di neoplasie ematologiche1,2 attraverso l’effetto GVL (innesto-contro-leucemia)3. Tuttavia, i linfociti del donatore montano sempre attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti ricitati, un processo chiamato malattia innesto-contro-ospite (GVHD)4.
I modelli Murine di GVHD sono uno strumento efficace per studiare la biologia del GVHD e la risposta GVL5. I topi sono un modello animale di ricerca conveniente. Sono piccoli ed efficacemente dosati con molecole e biologici nelle prime fasi dello sviluppo6. I topi sono animali di ricerca ideali per gli studi di manipolazione genetica perché sono geneticamente ben definiti, il che è ideale per studiare percorsi e meccanismi biologici6. Diversi modelli di GVHD non corrispondenti del complesso di istocompatibilità maggiore del mouse (MHC) di GVHD sono stati ben definiti, ad esempio C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e FVB (H2q) : C57BL/6 (H2b)5,7. Questi sono modelli particolarmente preziosi per determinare il ruolo dei singoli tipi di cellule, geni e fattori che influenzano il GVHD. Il trapianto da donatori genitori C57/BL/6 (H2b)a destinatari con mutazioni in MHC I (B6.C-H2bm1) e/o MHC II (B6.C-H2bm12) ha rivelato che un disallineamento sia nella classe MHC I che nella classe II è un requisito importante per lo sviluppo di GVHD acuto. Ciò suggerisce che sia le celluleCD4 e CD8 sono necessarie per lo sviluppo della malattia7,8. GVHD è anche coinvolto in una cascata infiammatoria conosciuta come la ‘tempesta di citochine pro-infiammatorie’9. Il metodo di condizionamento più comune nei modelli murini è l’irradiazione totale del corpo (TBI) da raggi X o 137C. Questo porta all’ablazione del midollo osseo del ricevente, permettendo così l’innesto delle cellule staminali del donatore e impedendo il rigetto dell’innesto. Questo viene fatto limitando la proliferazione delle cellule T del ricevente in risposta alle cellule donatrici. Inoltre, le disparità genetiche svolgono un ruolo importante nell’induzione delle malattie, che dipende anche da una mancata corrispondenza di MHC minori10. Pertanto, la dose di irradiazione mieloablativa varia in diversi ceppi di topo (ad es., BALB/c-C57BL/6).
L’attivazione di cellule T donatori da cellule di presentazione dell’antigene host (APC) è essenziale per lo sviluppo di GVHD. Tra gli APC, le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti. Sono ereditariamente in grado di indurre GVHD a causa del loro superiore assorbimento di antigeni, espressione di molecole co-stimolanti a cellule T e produzione di citochine pro-infiammatorie che polarizzano le cellule T in sottoinsiemi patogeni. I controller di dominio destinatari sono fondamentali per facilitare l’innesco delle cellule T e l’induzione del GVHD dopo il trapianto11,12. Di conseguenza, DC sono diventati obiettivi interessanti nel trattamento di GVHD12.
La TBI è necessaria per migliorare l’innesto delle cellule del donatore. A causa dell’effetto TBI, i controller di dominio destinatari vengono attivati e sopravvivono per un breve periodo dopo il trapianto12. Nonostante i grandi progressi nell’uso della bioluminescenza o della fluorescenza, stabilire un modello efficace per studiare il ruolo dei controller di dominio destinatari nel GVHD è ancora impegnativo.
Poiché le cellule T donatrici sono la forza motrice per l’attività GVL, strategie di trattamento che utilizzano farmaci immunosoppressivi come gli steroidi per sopprimere l’allreattività delle cellule T spesso causano ricaduta tumorale o infezione13. Pertanto, il targeting dei controller di dominio dei destinatari può fornire un approccio alternativo per trattare il GVHD preservando l’effetto GVL ed evitando l’infezione.
In breve, lo studio attuale fornisce una piattaforma per capire come i diversi tipi di segnalazione nei controller di dominio dei destinatari regolano lo sviluppo di GVHD e l’effetto GVL dopo BMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di cellule staminali per soddisfare un particolare individuo è un approccio efficace per trattare i tumori avanzati e resistenti18. I prodotti farmaceutici a piccola molecola, tuttavia, sono rimasti a lungo al centro della terapia oncologica personalizzata. D’altra parte, nella terapia cellulare una moltitudine di interazioni tra donatore e ospite può influenzare in modo decisivo gli esiti del trattamento, come lo sviluppo di GVHD dopo BMT1.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato dalla sovvenzione per la start-up dell’Università della Florida College of Medicine (a HN), dalla sovvenzione start-up Hillman Cancer Center dell’Università di Pittsburgh Medical Center (a HL), dal NIH Grant #1P20CA210300-01 degli Stati Uniti e dal Ministero vietnamita di Health Grant #4694/QD-BYT (a PTH). Ringraziamo il Dr. Xue-zhong Yu presso la Medical University of South Carolina per aver fornito materiali per lo studio.
Materials
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
Referencias
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