Summary

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

Published: October 08, 2019
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Summary

생화학 분석과 결합된 단백질 결합 마이크로어레이(PBM) 실험은 DNA 프리마제의 결합 및 촉매 특성을 연결하며, 이는 템플릿 DNA에 RNA 프라이머를 합성하는 효소입니다. 고처리량 프리마제 프로파일링(HTPP)으로 지정된 이 방법은 다양한 효소의 DNA 결합 패턴을 밝히는 데 사용될 수 있다.

Abstract

DNA 프리마제는 DNA 복제 중에 DNA 폴리머라제에 의해 지연 가닥에 오카자키 단편의 DNA 합성을 시작하는 짧은 RNA 프라이머를 합성합니다. DNA에 원핵 DNAG 같이 프리마제의 결합은 특정 삼중뉴클레오티드 인식 순서에서 생깁니다. 그것은 오카자키 조각의 형성에 중요한 단계입니다. DNA 프리마제의 DNA 인식 서열을 결정하는 데 사용되는 기존의 생화학 적 도구는 제한된 정보만을 제공한다. 고처리량 마이크로어레이 기반 결합 분석 및 연속적인 생화학 적 분석을 사용하여 1) 특정 결합 컨텍스트 (인식 부위의 측면 서열)가 DNA 프리마제의 결합 강도에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. DNA, 및 2) DNA에 프리마제의 강한 결합은 효소의 더 높은 처리율을 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 산출한다. 이 방법은 PBM 및 프리마제 활성 분석법을 결합하고 고처리량 프리마제 프로파일링 (HTPP)으로 지정되며 전례없는 시간과 확장성에서 DNA 프리마제에 의한 특정 서열 인식의 특성화를 허용합니다.

Introduction

HTPP는 생화학 적 분석과 결합 된 DNA 결합 마이크로 어레이 기술을 사용하여DNA프리마제의 효소 활성에 영향을 미치는 DNA 템플릿의 특정 특징을 통계적으로 식별합니다. 따라서 HTPP는 현장에서 지식의 도약을 촉진하는 기술 플랫폼을 제공합니다. 원시 인식 사이트를 결정하는 데 사용되는 고전적인 도구는 HTPP가 수행하는 반면, 엄청난 양의 데이터를 얻을 수있는 능력이 없습니다.

PBM은 DNA1,2에대한 전사 인자의 결합 선호도를 결정하기 위해 일상적으로 사용되는 기술이다. 그러나, DNA에 단백질의 약 /과도 결합의 검출에 적합하지 않습니다. 8개의 염기 쌍으로 구성된 모든 가능한 서열에 평균 단백질 결합 특이성에 대한 정보를 제공하는 보편적인 PBM과는 달리, HTPP는 독특한 서열 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA 템플릿의 라이브러리를 기반으로 한다. 이러한 DNA 서열 요소는 수만 짧은 (bp의 몇 수) 게놈 서열뿐만 아니라 다른 평균 GC 함량을 가지고 게놈에 존재하는 특정 DNA 반복적 인 서열 요소에 풍부 하게 계산 설계 DNA 서열을 포함 . 이러한 높은 처리량 접근법은 체계적이고 정량적이며 가설 구동적인 방식으로, 프리마제 결합 및 그 효소 활성에 중요한 서열 관련 특성을 결정할 수 있게한다 3. 특히, 프리마제-DNA 결합 선호도(특정 삼중 뉴클레오티드 결합 부위를 측면으로 하는 DNA 서열에 의해 변조)와 프리마제 처리율 사이의 중요한 링크가 이러한 효소 시스템4에대해 확인되었다.

이 새로운 기술은 광범위하게 연구된 T7 DNA 프리마제에 대해서도 프리마제 인식 부위에 대한 우리의 이해를 재검토하기 위해 적용되었다5. 구체적으로, 단백질 DNA 결합 마이크로어레이(PBM)를 사용하여 T7 DNA 프리마제(거의 4년 전 6년전에 결정된)의 DNA 인식 부위와 같은 고전적인 개념의 재검사는 이러한 인식 사이트의 측면 시퀀스3. T7 DNA 프리마제(5′-GTC-3′)의 삼중뉴클레오티드 인식 부위를 측면으로 하는 서열이 무작위일 것으로 예상되었다. 대신, 우리는 TG가 풍부한 측면 서열이 처리율의 증가를 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 합성하는 T7 DNA 프리마제의 기회를 증가한다는 것을 것을을 발견했습니다.

시험관 내 단백질의 DNA 결합 특성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다른 방법은 전기 영동 이동성 시프트 분석법(EMSA)7,DNase I 풋프린트8,표면 플라스몬 공명(SPR)9,및 남서부 블로팅을 포함합니다. 10. 그러나, 이들은 적은 수의 DNA 서열을 조사하는 데에만 적용 가능한 저처리법입니다. 또한, 이러한 기술 들(예를 들어, EMSA)의 정밀도 및 감도는 낮다. 한편, 시험관내선택(11)은 PBM과 유사하게, 수많은 결합 서열의 식별을 위해 사용될 수 있는 기술이다. 그러나, 낮은 친화도 서열은 일반적으로 시험관 내 선택의 대부분의 응용 프로그램에서 제외; 따라서 이 방법은 사용 가능한 모든 시퀀스에 대한 비교 바인딩 데이터를 가져오는 데 적합하지 않습니다. 범용 PBM1,2는 주로 원핵생물 및 진핵생물로부터의 전사 인자의 결합 특이성뿐만 아니라 특정 인자(예를 들어, 특정 리간드, 보조 인자 등)의 결합 특이성을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 상호 작용에 영향을미치는 12.

HTPP는 전례없는 높은 처리량의 통계적 파워와 높은 정밀도를 결합하여 결합 서열 컨텍스트에 대한 정보를 제공함으로써 PBM 응용 프로그램을 DNA 처리 효소로 확장합니다. 이러한 데이터는 다른 사용 가능한 기술의 전술한 기술적 한계로 인해 프리마제 및 관련 효소(DNA에 약/과도 결합)에 대해 아직 획득되지 않았습니다.

Protocol

1. 마이크로어레이 의 설계 참고: DNA 프로브는 2개의 가변 측면 영역 사이에 위치한 T7 DNA 프리마제(GTC)에 대한 인식 부위로 구성된 맞춤형 36-뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이어서 유리 슬라이드3에연속된 일정한 24-뉴클레오티드 서열이 뒤따른다. 우리는 4 x 180,000 마이크로어레이 형식을 사용하여 슬라이드에 무작위로 분포된 6개의 복제본에서 각 DNA 서열을 ?…

Representative Results

프리마제 결합 부위를 매핑하기 위한 이러한 기술적 진보는 고전적 도구를 사용하여 관찰하기 어려운 DNA 결합 특성을 얻을 수 있게 한다. 더 중요한 것은, HTPP는 프리마제 바인딩 사이트의 전통적인 이해를 다시 방문 할 수 있습니다. 구체적으로, HTPP는 알려진 5′-GTC-3′ 인식 서열 이외에 결합 특이성을 밝혀, 이는 T7 DNA 프리마제의 기능적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 서열의…

Discussion

PBM 방법은 전사 인자의 결합 특성을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔으며 DNA 프리마제와 같은 DNA 처리 효소에 적용되어 친화성이 낮은 DNA에 결합할 수도 있습니다. 그러나 실험 절차의 특정 수정이 필요합니다. 마이크로어레이 실험은 DNA 라이브러리의 설계, 칩의 준비, 단백질 표적의 결합, 형광 표지 및 스캐닝과 같은 여러 단계를 수반합니다. 세제를 함유한 용액을 가진 긴 세척은 결합의 약한/?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 이스라엘 과학 재단에 의해 지원되었다 (부여 번호 1023/18).

Materials

40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

Referencias

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
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Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

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