Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Le HTPP utilise la technologie de microréseau de liaison de l’ADN combinée à l’analyse biochimique (Figure 1) pour identifier statistiquement les caractéristiques spécifiques des modèles d’ADN qui affectent l’activité enzymatique de la primase de l’ADN. Par conséquent, HTPP fournit une plate-forme technologique qui facilite un saut de connaissances dans le domaine. Les outils classiques utilisés pour déterminer les sites de reconnaissance primase n’ont pas la capacité de produire une quantité massive de données, alors que le PTDH le fait.

LE PBM est une technique couramment utilisée pour déterminer les préférences de liaison des facteurs de transcription à l’ADN^1,2; cependant, il n’est pas approprié pour la détection de la liaison faible/transitoire des protéines à l’ADN. Contrairement au PBM universel qui fournit des informations sur la spécificité moyenne de liaison des protéines à toutes les séquences possibles composées de huit paires de base, HTPP est basé sur la bibliothèque de modèles d’ADN à brin unique comprenant des éléments de séquence uniques. Ces éléments de séquence d’ADN impliquent des dizaines de milliers de séquences génomiques courtes (quelques dizaines de bp), ainsi que des séquences d’ADN conçues par calcul enrichies dans certains éléments de séquence répétitive d’ADN présents dans le génome, qui possèdent un contenu moyen différent de GC . Une telle approche à haut débit permet de déterminer, de manière systématique, quantitative et hypothétique, les propriétés liées à la séquence qui sont importantes pour la liaison primase et son activité enzymatique³. En particulier, le lien important entre les préférences de liaison primase-ADN (modulées par des séquences d’ADN flanquant des sites de liaison trinucléotides spécifiques) et la processivité primase a été identifiée pour ce système enzymatique⁴.

La nouvelle technologie a été appliquée pour revoir notre compréhension des sites de reconnaissance primase, même pour la primase de l’ADN T7 qui a fait l’objet d’études approfondies⁵. Plus précisément, le réexamen de concepts classiques, tels que les sites de reconnaissance de l’ADN de primase de l’ADN T7 (qui ont été déterminés il y a près de quatre décennies ⁶) à l’aide d’un microréseau liant protéine-ADN (PBM) a permis d’obtenir un aperçu sans précédent des caractéristiques liées aux la séquence de flanc de ces sites de reconnaissance³. On s’attendait à ce que les séquences flanquant le site de reconnaissance trinucléotide de la primase d’ADN T7 (5′-GTC-3′) soient aléatoires. Au lieu de cela, nous avons constaté que les séquences de flanc TG-riches augmentent les chances de primase d’ADN de T7 pour synthétiser des amorces plus longues d’ARN indiquant une augmentation de processivity.

D’autres méthodes qui peuvent être utilisées pour étudier les propriétés de liaison de l’ADN des protéines in vitro comprennent l’analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)⁷, DNase I empreinte⁸, résonance de surface-plasmon (SPR)⁹, et le sud-ouest ballonnement ¹⁰. Il s’agit toutefois de méthodes à faible débit qui ne s’appliquent qu’à l’étude d’un petit nombre de séquences d’ADN. De plus, la précision et la sensibilité de certaines de ces techniques (p. ex., EMSA) sont faibles. D’autre part, la sélection in vitro¹¹ est une technique qui, tout comme PBM, peut être utilisée pour l’identification de nombreuses séquences de liaison. Cependant, les séquences de faible affinité sont généralement exclues dans la plupart des applications de la sélection in vitro; par conséquent, cette approche n’est pas adaptée pour obtenir des données comparatives de liaison pour toutes les séquences disponibles. Le PBM^1,2 universel est principalement utilisé pour caractériser les spécificités de liaison des facteurs de transcription des procaryotes et des eucaryotes ainsi que des facteurs spécifiques (par exemple, la présence de certains ligands, cofacteurs, etc.) qui peuvent affecter cette interaction¹².

HTPP étend l’application PBM aux enzymes de traitement de l’ADN en combinant une puissance statistique à haut débit sans précédent avec une grande précision pour fournir des informations sur le contexte de séquence de liaison. Ces données n’ont pas encore été obtenues pour les primases et les enzymes connexes (qui ont une liaison faible/transitoire à l’ADN) en raison des limitations techniques susmentionnées d’autres techniques disponibles.