Presentiamo qui un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti indotte in ogni derivato di somite (Miotomo, sclerotomo, dermatome e syndetome) in condizioni chimicamente definite, che ha applicazioni nella modellazione di malattia futura e terapie basate su cellule in chirurgia ortopedica.
In risposta a segnali quali WNT, bone morphogenetic proteins (BMPs) e sonic hedgehog (SHH) secernuto dai tessuti circostanti, somiti (SMs) danno luogo a più tipi di cellule, tra cui il miotomo (MYO), sclerotomo (SCL), dermatome (D) e syndetome (SYN) , che a sua volta trasformarsi in muscolo scheletrico, scheletro assiale, derma dorsale e assiale del tendine/legamento, rispettivamente. Pertanto, la generazione di SMs e loro derivati da cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) è fondamentale per ottenere cellule staminali pluripotenti (PSC) per applicazioni in medicina rigenerativa e per la ricerca di malattia nel campo della chirurgia ortopedica. Anche se i protocolli di induzione per MYO e SCL da PSC precedentemente sono stati segnalati da diversi ricercatori, nessuno studio ha ancora dimostrato l’induzione di SYN e D da iPSCs. Di conseguenza, induzione efficiente di SMs completamente competente rimane una sfida importante. Qui, abbiamo ricapitolare umano patterning di SM con iPSCs umane in vitro imitando l’ambiente segnalazione durante lo sviluppo di SM pulcino/mouse e relazione sui metodi di induzione sistematica dei derivati di SM (MYO, SCL, D e SYN) da iPSCs umane sotto chimicamente condizioni definite attraverso il mesoderm presomitic (PSM) e Stati di SM. Conoscenza per quanto riguarda lo sviluppo del pulcino/mouse SM è stato applicato con successo all’induzione di SMs con iPSCs umane. Questo metodo potrebbe essere un nuovo strumento per studiare umano somitogenesis e patterning senza l’uso di embrioni e per la modellazione di malattia e di terapia cellulare.
Lo sviluppo di un metodo di differenziazione diretto per un tipo di cella desiderata da sportelli unici è un passo necessario per tradurre lo studio di cellule derivanti dal PSC in applicazioni cliniche. Sovraespressione di geni chiave è una strategia promettente per organo-differenziamento da PSC e ha migliorato la nostra comprensione della regolazione genetica della determinazione del destino cellulare, la morfogenesi organo e organizzazione durante l’embriogenesi1. Inoltre, ricapitolare gli ambienti segnalazione endogeni, mediante lo sviluppo di embrioni di topo e pulcino come una tabella di marcia, è considerato essenziale per la differenziazione diretto degli sportelli unici. Tuttavia, la strategia di quest’ultima dato l’applicazione di cellule derivanti dal PSC in studi clinici come terapie basate sulle cellule, è più adatta perché non richiede la manipolazione genica.
Parecchi studi hanno riferito l’induzione del mesoderma dall’essere umano e del mouse PSC in condizioni definite chimicamente. In genere, questi metodi hanno invocato activin/nodale/trasformando la segnalazione di β (TGFβ) fattore di crescita e ossea morfogenetica (BMP) di segnalazione, creduto per eseguire la differenziazione meso-endoderma e mesoderma, conseguente a un’efficienza bassa induzione del il parassiale mesoderma (20% circa)2. In altre parole, il mesoderma PSC-derivato indotto da queste vie di segnalazione è stato principalmente mesoderma della piastra laterale e non il mesoderma parassiale. Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato la produzione efficiente di mesoderma parassiale PSC-derivato basato su diverse strategie3,4,5,6,7,8 . In questi studi, gli sportelli unici sono stati coltivati con concentrazioni relativamente alte di chinasi 3 (GSK3) di glicogeno sintasi inibitori (attivatori di segnalazione WNT), di conseguenza l’efficienza di induzione del mesoderma parassiale raggiunto 70% – 95%6,7 .
In somitogenesis, il mesoderma parassiale prima forma mesoderm presomitic (PSM) posteriormente e quindi costituisce somiti (SMs) nella parte anteriore attraverso transizione mesenchima–epiteliale9,10. Ligando tacca del Delta-tipo 1 (DLL1) è noto per avere un ruolo fondamentale durante la somitogenesis, come controllo oscillatoria dell’espressione DLL1, sia a livello di mRNA e proteine, regola la segmentazione SM. SMs alla fine suddividere in due parti, dando luogo a dermomyotome (DM), dorsalmente e sclerotomo (SCL) ventralmente11. Successivamente, il DM si differenzia in dermatome (D), un precursore del derma e Miotomo (MYO), un precursore del muscolo scheletrico; Inoltre, una porzione ventrale del SCL forma syndetome (SYN), un precursore di tendini e legamenti12 (Figura 1). Alcuni ricercatori hanno segnalato l’induzione di derivati di PSC-derivato SM come MYO4,13 e SCL14; Tuttavia, ci sono diverse limitazioni in questi studi. In particolare, dal momento che la nostra conoscenza degli ambienti segnalazione di D e SYN è frammentario, protocolli di induzione per D e SYN non sono ancora state sistematicamente stabilite. Per dimostrare la competenza completa di SMs indotta da sportelli unici, è essenziale per mostrare la multi-differenziazione capacità di SMs indotta in tutti e quattro i derivati (D, MYO, SCL e SYN), mentre gli studi precedenti si sono concentrati solo su specifici derivati di SM. Qui, segnaliamo su come generare tutti i quattro derivati di SM, anche D e SYN, attraverso destini PSM e SM da umano iPSCs15. Siamo convinti che stabilire un metodo graduale in vitro che modella il processo di sviluppo di SM potrebbe contribuire allo studio della SM come umano si sviluppa durante l’embriogenesi, senza l’utilizzo di embrioni.
Un metodo ben noto per l’induzione del PSC-derivato SM attraverso PSM è la combinazione di CHIR99021 + A83-01 (inibitore di TGFβ) durante l’induzione di PSM dal PSC, ma non durante il processo di maturazione PSM6. Nello studio presente, la segnalazione WNT/beta-catenina è stata inibita utilizzando C59 per indurre SM da PSM. Tuttavia, abbiamo introdotto l’uso di CHIR99021 per attivare la via di WNT durante la differenziazione di SM. Questa decisione è stata fatta basato sulla constatazione che diversi Wnt sono espressi nei tessuti circostanti di SM e dato il fatto che i giornalisti WNT sono attivi nella SM20. Di conseguenza, abbiamo osservato epithelialization, una caratteristica della SM in vivo solo sotto la condizione con CHIR99021, basato sull’accumulo di CDH11 in giunzioni della cellula-cellula (Figura 2E). Questa osservazione indica il coinvolgimento critico di WNT segnalazione durante la differenziazione di PSM ed epithelialization SM, quindi il nostro protocollo può meglio ricapitolare l’ambiente segnalazione endogena. Tuttavia, essa implica anche un’ulteriore possibilità di messa a punto la durante il differenziamento, la via di segnalazione WNT/beta-catenina perché la robustezza e l’efficienza della differenziazione potrebbe variare notevolmente a seconda i tipi cellulari, linee cellulari e vari composti chimici di WNT-induttori utilizzati da ciascun ricercatore.
Questo metodo permette anche di generare tutti i quattro SM derivati, MYO, D, SCL e SYN, da iPSCs umane. I nostri protocolli graduale utilizzando CDM possono essere utilizzati per identificare i requisiti di segnalazione durante umano somitogenesis/somite patterning e forniscono le comprensioni importanti sullo sviluppo dei SM. Ad esempio, i nostri metodi potrebbero essere utili per studiare i meccanismi di segmentazione dell’orologio, un sistema di oscillazione molecolare che regola la formazione di SM. È stato accuratamente studiato in topi e pulcini in zebrafish, ma non in esseri umani a causa della mancanza di adeguati strumenti sperimentali.
Inoltre, il nostro metodo può essere applicabile a future terapie basate sulle cellule cliniche. Ad esempio, D iPSC-derivati umani o SYN possono essere trapiantati in pelle gravemente danneggiata o tendini per la rigenerazione e trattamento. Tuttavia, numerose limitazioni devono essere risolti prima che questo metodo può essere applicato praticamente. Anche se nel presente studio, abbiamo usato le cellule di alimentatore SNL per iPSC manutenzione e soluzione di ECM, che viene estratta dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm, come un rivestimento superficiale sul piatto durante l’induzione, questi reagenti di derivazione animale non umano dovrebbero essere rimosso per migliorare la qualità clinica. Inoltre, la cella quantità e qualità, che comprende la purezza e la maturazione delle cellule desiderate, inoltre deve essere migliorati. Inoltre, non solo il numero di cellulare, ma anche la forza delle cellule è una caratteristica importante per la rigenerazione del legamento/del tendine. Inoltre, lo sviluppo di marcatori di superficie per purificazione e un metodo novello per la ricostituzione 3D sono indispensabili al fine di avanzare i nostri protocolli alla clinica delle terapie basate sulle cellule.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il Dr. Junya Toguchida (CiRA) per il suo aiuto con la gestione del progetto e finanziamento acquisizione, signor Mitsuaki Shibata (CiRA) e Sig. ra Mei Terashima (CiRA) per la loro assistenza tecnica, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) e Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) per loro revisione del manoscritto e Mr. Masaya Todani (CiRA) per fornire l’illustrazione (Figura 1). Ringraziamo anche tutti i membri dei laboratori Ikeya e Toguchida (CiRA) per il loro supporto durante questo studio. Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per la ricerca scientifica della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) (26670661), il programma per le cellule iPS insolubile malattie ricerca utilizzando malattia-specifica dal Giappone scienza e tecnologia Agenzia (JST) e l’Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED), il centro di Core per iPS Cell Research il centro della rete di ricerca per la realizzazione di medicina rigenerativa (JST/AMED) e iPS Cell Research Fund (in parte a Makoto Ikeya e Junya Toguchida). Makoto Ikeya è stato anche supportato da localizzativi per ricerca scientifica (JSPS) (16H 05447) e il programma di accelerazione per la ricerca di malattie intrattabili che utilizzano le cellule iPS specifici di malattia (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |