نقدم هنا بروتوكولا للتفريق بين الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent في كل مشتق سميط (ميوتومي، سكليروتومي، ديرماتومي، وسينديتومي) في ظروف محددة كيميائيا، والتي لها تطبيقات في النمذجة المرض مستقبلا و العلاجات المستندة إلى الخلية في جراحة العظام.
واستجابة لإشارات مثل WNTs، العظام البروتينات مورفوجينيتيك (BMPs)، والقنفذ سونيك (SHH) ويفرز من الأنسجة المحيطة، سميتس (SMs) أن تؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك ميوتومي (ميو)، سكليروتومي (SCL)، ديرماتومي (د)، وسينديتومي (SYN) ، التي تتطور بدورها إلى الهيكل العظمى والعضلات والهيكل العظمى المحوري، الأدمة الظهرية ووتر المحوري/الرباط، على التوالي. ولذلك، توليد SMs ومشتقاتها من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أمر حاسم للحصول على الخلايا الجذعية pluripotent (PSCs) للتطبيق في الطب التجديدي والبحوث في مجال الأمراض في مجال جراحة العظام. على الرغم من أن بروتوكولات تحريض ميو و SCL من PSCs أبلغ سابقا بالعديد من الباحثين، قد دللت دراسة لا بعد التعريفي اصطناعي ومد من إيبسكس. ولذلك، يظل كفاءة تحريض SMs مؤهلة تماما تحديا كبيرا. هنا، نحن الخص الزخرفة SM البشرية مع إيبسكس البشرية في المختبر عن طريق محاكاة البيئة إرسال الإشارات خلال التنمية SM الفرخ/الماوس، وتقرير عن طرق الاستقراء المنهجي لمشتقات SM (ميو SCL، د وأزل) من إيبسكس البشرية تحت كيميائيا شروط محددة من خلال بريسوميتيك mesoderm (PSM) والدول SM. المعرفة بشأن التنمية SM الفرخ/الماوس تم تطبيقها بنجاح على استحثاث SMs مع إيبسكس البشرية. هذا الأسلوب يمكن أن تكون أداة جديدة لدراسة سوميتوجينيسيس البشري والزخرفة دون استخدام الأجنة والنمذجة المرض والعلاج يستند إلى الخلية.
تطوير أسلوب المفاضلة موجهة لنوع خلايا المطلوب من PSCs خطوة ضرورية لترجمة دراسة الخلايا المستمدة من PSC إلى التطبيقات السريرية. التعبير القسري من الجينات الرئيسية هو استراتيجية واعدة لتمايز خلايا الجهاز من شركات الأمن الخاصة وتحسن فهمنا لتنظيم الوراثية لتحديد مصير الخلية والجهاز morphogenesis والمنظمة خلال embryogenesis1. وباﻹضافة إلى ذلك، لخص البيئات الإشارات الذاتية، باستخدام تطوير الأجنة الفأرة والفرخ كخارطة طريق، تعتبر ضرورية للتفريق بين توجيه PSCs. ومع ذلك، نظراً للتطبيق المستمدة من PSC خلايا في الدراسات السريرية مثل العلاجات المستندة إلى الخلية، الاستراتيجية الأخيرة أكثر ملاءمة نظراً لأنها لا تتطلب معالجة الجينات.
أفادت دراسات عدة تحريض ميسوديرم من البشر وكيميائيا المعرفة PSCs الماوس في الظروف. عادة، قد اعتمدت على أضافت/العقدي/تحويل عامل النمو β (TGFβ) مما يشير إلى هذه الأساليب والعظام إشارات morphogenetic البروتين (BMP)، ويعتقد أن أداء التمايز ميزو-الأنسجة و mesoderm، مما أدى كفاءة منخفضة التعريفي إلى ال برازيل mesoderm (20 في المائة تقريبا)2. وبعبارة أخرى، كان mesoderm المستمدة من PSC التي تحدثها هذه المسارات مما يشير إلى أساسا mesoderm اللوحة الجانبية، ولا باراكسيال mesoderm. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت الدراسات قليلة الإنتاج الفعال ل mesoderm المستمدة من PSC برازيل استناداً إلى استراتيجيات مختلفة3،،من45،،من67،8 . وفي هذه الدراسات، كانت مثقف PSCs مع تركيزات عالية نسبيا من الجليكوجين synthase كيناز 3 (GSK3) مثبطات (WNT تفعيل الإشارات)، وبالتالي كفاءة التعريفي paraxial mesoderm بلغت 70% – 95%6،7 .
أولاً في سوميتوجينيسيس، mesoderm برازيل أشكال mesoderm بريسوميتيك (PSM) جيدة، ويشكل سميتس (SMs) ثم في الجزء الأمامي من خلال مرحلة انتقالية mesenchyme إلى الظهارية9،10. يجند الدرجة 1 مثل دلتا (DLL1) المعروف أن يكون دوراً محوريا خلال سوميتوجينيسيس، كما تحكم متذبذبة DLL1 التعبير، سواء في مستوى البروتين ومرناً، وينظم تجزئة SM. تقسيم الرسائل القصيرة في نهاية المطاف إلى اثنين من الأجزاء، مما أدى إلى ديرموميوتومي (ألماني) دورسالي وسكليروتومي (SCL) بطنيا11. وفي وقت لاحق، يميز مارك ألماني في ديرماتومي (د)، مقدمة من الأدمة، وميوتومي (ميو)، تمهيدا للهيكل العظمى والعضلات؛ بالإضافة إلى ذلك، تشكل نسبة البطني من SCL سينديتومي (SYN)، تمهيدا ل الأوتار والأربطة12 (الشكل 1). وأفادت بعض الباحثين التعريفي للمشتقات المالية المستمدة من PSC SM مثل ميو4،13 و14من SCL؛ ومع ذلك، هناك العديد من القيود في هذه الدراسات. جدير بالذكر أن نظراً لمعرفتنا بالبيئات مما يشير إلى د وأزل مجزأ، بروتوكولات التعريفي د وأزل لا بعد بشكل منهجي أنشئت. لشرح الكامل-اختصاص SMs التي يتسبب فيها من شركات الأمن الخاصة، من الضروري إظهار التمايز المتعدد قدرة SMs المستحث في جميع المشتقات أربعة (د، ميو، SCL واصطناعي)، في حين أن الدراسات السابقة ركزت فقط على المشتقات SM محددة. هنا، نحن تقريرا عن كيفية توليد جميع المشتقات SM أربعة، بما في ذلك مد واصطناعي، من خلال مصائر PSM و SM من إيبسكس البشرية15. ونحن نعتقد أن إنشاء أسلوب متدرج في المختبر أن النماذج التي يمكن أن تسهم عملية التنمية SM دراسة SM البشرية كيف يتطور خلال embryogenesis، دون استخدام الأجنة.
طريقة معروفة لاستحثاث المستمدة من PSC SM من خلال إدارة المشتريات والتوريدات هو المزيج من CHIR99021 + A83-01 (مثبط TGFβ) خلال الاستقراء PSM من PSC، ولكن ليس أثناء عملية النضج PSM6. في هذه الدراسة، إشارات WNT/بيتا-كاتينين كان يعوق استخدام C59 للحث على SM من إدارة المشتريات والتوريدات. ومع ذلك، ادخلنا استخدام CHIR99021 لتنشيط مسار WNT خلال التمايز SM. اتخذ هذا القرار بناء على استنتاج أن WNTs عدة أعربت في الأنسجة المحيطة بها من SM ونظرا لحقيقة أن الصحفيين WNT ينشط في SM20. نتيجة لذلك، لاحظنا epithelialization، سمة من سمات SM الحية، إلا بموجب الشرط مع CHIR99021، استناداً إلى تراكم CDH11 في تقاطعات–الخلية (الشكل 2E). وهذه الملاحظة تشير إلى مشاركة حاسمة WNT الإشارات خلال التمايز PSM و epithelialization SM، ولذلك لدينا بروتوكول قد الخص أفضل مما يشير إلى البيئة المحلية. ومع ذلك، فإنه يعني أيضا إمكانية أخرى لصقل WNT/بيتا-كاتينين إشارات الطريق خلال التمايز، نظراً لقوة وكفاءة من التمايز قد تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لأنواع الخلايا، وخطوط الخلية، ومختلف المركبات الكيميائية من WNT-المحرضات التي يستخدمها كل باحث.
هذا الأسلوب يسمح لنا أيضا لتوليد كل أربعة SM المشتقات، ميو، د، SCL، واصطناعي، من إيبسكس البشرية. لدينا بروتوكولات التدرجي باستخدام إليه التنمية النظيفة يمكن استخدامها لتحديد متطلبات إرسال الإشارات خلال البشرية سوميتوجينيسيس/سميط الزخرفة، وتقدم أفكاراً هامة في التنمية البشرية SM. على سبيل المثال، يمكن أن يكون لدينا أساليب مفيدة لدراسة آليات تجزئة على مدار الساعة، نظام التذبذب جزيئية التي تنظم تشكيل SM. قد حققت دقة في الفئران والدجاج والزرد، ولكن ليس في البشر بسبب الافتقار إلى الأدوات التجريبية المناسبة.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون لدينا أسلوب تنطبق على المستقبل العلاج السريري يستند إلى الخلية. على سبيل المثال، د البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية أو اصطناعي يمكن زرعها في شدة إصابة الجلد أو تمزق الأوتار للتجدد والعلاج. ومع ذلك، العديد من القيود يلزم حلها قبل هذا الأسلوب يمكن تطبيقها عمليا. على الرغم من أن في هذه الدراسة، كنا SNL تغذية الخلايا للحفاظ على اللجنة التوجيهية وحل إدارة المحتوى في المؤسسة، والذي يستخرج من ساركومه الماوس انجيلبريث-هولم-سرب، كمعطف سطحية على الطبق أثناء التعريفي، وينبغي أن تكون هذه الكواشف المستخلصة من الحيوانات غير البشرية إزالة لتحسين الجودة السريرية. وباﻹضافة إلى ذلك، الخلية الكمية والنوعية، التي تضم النقاء ونضوج الخلايا المطلوب، يجب أيضا تحسين. وعلاوة على ذلك، عدد الخلايا ليس فقط ولكن أيضا قوة الخلية سمة هامة لتجديد وتر/الرباط. بالإضافة إلى ذلك، يتم وضع علامات السطحية لتنقية وطريقة جديدة لإعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد لا غنى عنها من أجل المضي قدما لدينا بروتوكولات للعلاج السريري يستند إلى الخلية.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر الدكتور جونيا توجوتشيدا (بنا) لمساعدته مع إدارة المشروع، وتمويل اقتناء، السيد ميتسواكي شيباتا (بنا) والسيدة مي تيراشيما (بنا) للمساعدة التقنية، والدكتور Yayoi تويوكا (بنا) والدكتور دايسوكي كاميا (بنا) على على تصحيح التجارب المطبعية المخطوط، والسيد ماسايا توداني (بنا) لتوفير مثال (الشكل 1). ونشكر أيضا جميع أعضاء مختبرات إيكييا وتوجوتشيدا (بنا) على دعمهم خلال هذه الدراسة. هذا العمل يدعمها الإقراض “البحث العلمي” من “الجمعية اليابانية” للترويج للعلوم (JSPS) (26670661)، البرنامج لخلايا iPS المستعصية أمراض بحوث الاستفادة من المرض محددة من اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة (JST)، والوكالة اليابانية “الأبحاث الطبية” والتنمية (AMED)، ومركز iPS “أبحاث الخلايا” شبكة مركز البحوث “تحقيق الطب التجديدي” (JST/AMED)، والبرامج المتكاملة “وصندوق أبحاث الخلية” الأساسية (في جزء منه إلى ايكيا ماكوتو و جونيا توجوتشيدا). كما أيده ايكيا ماكوتو معونة للبحوث العلمية (JSPS) (ح 16 05447) و “برنامج تسريع” “بحوث أمراض مستعصية على الحل” استخدام خلايا iPS الخاصة بالمرض (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |