אנו מציגים כאן עבור הבידול בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי לתוך כל נגזרת somite (myotome, sclerotome, פלסטיים ו syndetome) פרוטוקול בתנאים מוגדרים כימי, אשר יש יישומים בדוגמנות מחלות בעתיד, טיפולים מבוססי תא לכירורגיה אורטופדית.
בתגובה אותות כגון WNTs, עצם morphogenetic חלבונים (BMPs) ו סוניק הקיפוד (ששש) מופרש מן הרקמות הסובבות, somites (SMs) להצמיח סוגי תאים מרובים, כולל את myotome (MYO), sclerotome (SCL), פלסטיים (D) ו syndetome (SYN) , אשר בתורו להתפתח שרירי השלד, axial שלד, הדרמיס הגבי ו צירית גיד/רצועה, בהתאמה. לכן, הדור של SMs ונגזרותיהם מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) הוא קריטי כדי לקבל גזע pluripotent (מגירסה) עבור יישום של רפואה רגנרטיבית, מחלות מחקר בתחום של כירורגיה אורתופדית. למרות שהפרוטוקולים אינדוקציה MYO, SCL החל מגירסה דווחו בעבר על ידי מספר חוקרים, אף מחקר עדיין הוכיחה את תנאי הגיוס של SYN D מ iPSCs. לכן, אינדוקציה יעיל של SMs המוסמכת באופן מלא נשאר אתגר גדול. כאן, אנו לסכם האנושי SM המתבנת עם iPSCs אנושיים במבחנה על ידי מחקה את הסביבה איתות במהלך חומוס/עכבר SM ופיתוח דוח על שיטות האינדוקציה שיטתית של נגזרות SM (MYO, SCL, D ו- SYN) מ- iPSCs האנושי תחת כימית תנאים מוגדרים באמצעות presomitic והמזודרם (PSM) ו- SM הברית. הידע לגבי בחורה/עכבר SM פיתוח הוחל בהצלחה על אינדוקציה של SMs עם iPSCs האנושית. שיטה זו יכולה להיות כלי הרומן לומד האדם somitogenesis תכנים ללא השימוש של העוברים טיפול מבוססת תא, מידול המחלה.
פיתוח שיטה התמיינות מכוונת לסוג התא הרצוי החל מגירסה היא צעד הכרחי לתרגום המחקר הנגזרות PSC תאים לתוך יישומים קליניים. ביטוי מאולץ של גנים מפתח אסטרטגיה מבטיח איברים תאית התמיינות החל מגירסה, השתפרה ההבנה שלנו של התקנון גנטי של גורל תא בנחישות, מורפוגנזה איברים, וארגון במהלך מופרה1. בנוסף, recapitulating את סביבות איתות אנדוגני, באמצעות הפיתוח של העוברים של עכבר חומוס כמו מפת דרכים, הוא נחשב חיוני הבידול בבימויו של מגירסה. בהתחשב היישום של תאים נגזר PSC במחקרים קליניים כגון טיפולים מבוססי תאים, האסטרטגיה השנייה זאת, מתאים יותר כי הוא אינו דורש מניפולציה ג’ין.
מספר מחקרים דיווחו על אינדוקציה של והמזודרם מן האדם, העכבר מגירסה כימית שהוגדרו בתנאי. בדרך כלל, שיטות אלה צריכים לסמוך על activin/קטרי/הפיכת איתות β (TGFβ) גורם גדילה ועצמות חלבון morphogenetic (BMP) איתות, האמין לבצע בידול meso-האנדודרם, והמזודרם, וכתוצאה מכך יעילות נמוכה אינדוקציה והמזודרם (כ-20%) paraxial2. במילים אחרות, והמזודרם, נגזר PSC המושרה על ידי איתות המסלולים האלה היה בעיקר לרוחב הלוח והמזודרם, לא paraxial והמזודרם. לאחרונה, מחקרים אחדים הדגימו ייצור יעיל של והמזודרם paraxial, נגזר PSC בהתבסס על אסטרטגיות שונות3,4,5,6,7,8 . במחקרים אלה, היו מגירסה תרבותי עם ריכוזים גבוהים יחסית של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3) מעכבי (ונ ט מפעילים איתות), כתוצאה מכך היעילות אינדוקציה של paraxial והמזודרם הגיעו 70%-95%6,7 .
ב somitogenesis, והמזודרם paraxial קודם טפסים posteriorly את והמזודרם presomitic (PSM) וטפסים ואז somites (SMs) בחלק הקדמי עד מזנכימה-כדי-אפיתל המעבר9,10. חריץ ליגנד כמו דלתא 1 (DLL1) ידוע יש תפקיד מרכזי במהלך somitogenesis, כמו שליטה מתנדנדות על הביטוי DLL1, הן ברמת mRNA, חלבון, מווסת את פילוח SM. SMs בסופו של דבר לסעף לתוך שני חלקים, והוליד dermomyotome (DM) dorsally, sclerotome (SCL) ventrally11. לאחר מכן, DM מבדילה לתוך פלסטיים (D), הקדמה של הדרמיס, וכן myotome (MYO), הקדמה של שריר השלד; בנוסף, בחלק הגחוני SCL יוצרת את syndetome (SYN), סימן מקדים של הגידים והרצועות12 (איור 1). יש חוקרים דיווחו על אינדוקציה של SM נגזר PSC נגזרים כגון MYO4,13 ו- SCL14; עם זאת, ישנן מספר מגבלות במחקרים אלה. ראוי לציין, מאחר הידע שלנו סביבות איתות של D ו- SYN מקוטעים, אינדוקציה פרוטוקולים עבור D ו- SYN לא עדיין באופן שיטתי הוקמו. להפגין המלא-סמכות של SMs המושרה החל מגירסה, זה חיוני כדי להראות את הבידול מרובי קיבולת SMs המושרה לתוך כל ארבע הנגזרים (D MYO, SCL, SYN), ואילו מחקרים קודמים התמקדו רק ספציפיים נגזרים SM. כאן, אנו מדווחים על איך ליצור כל נגזרים SM ארבע, לרבות D ו- SYN, באמצעות PSM ו- SM הגורל האנושי iPSCs15. אנו מאמינים כי הקמת שיטה stepwise במבחנה כי מודלים תהליך הפיתוח SM יכול לתרום המחקר של SM אנוש מפתחת במהלך מופרה, ללא שימוש עוברי.
שיטה ידועה אינדוקציה של נגזר PSC SM דרך PSM הוא השילוב של CHIR99021 + A83-01 (TGFβ מעכב) במהלך PSM אינדוקציה של PSC, אך לא את תהליך ההבשלה PSM6. במחקר הנוכחי, ונ ט/בטא-catenin איתות היה עכבות באמצעות C59 לזירוז SM מ PSM. עם זאת, הצגנו את השימוש CHIR99021 כדי להפעיל את השביל ונ ט במהלך בידול של SM. החלטה זו התקבלה בהתבסס על הממצאים כי מספר WNTs הם הביעו ברקמות שמסביב של SM, בהתחשב בעובדה כי ונ ט כתבים פעילים SM20. כתוצאה מכך, הבחנו epithelialization, מאפיין של SM ויוו, רק תחת התנאי עם CHIR99021, בהתבסס על ההצטברות של CDH11 ב צמתי תא-תא (2E איור). התבוננות זו מצביע על מעורבות ביקורתית של חגיגת איתות במהלך PSM בידול של SM epithelialization, לכן שפרוטוקול שלנו אולי כדאי לסכם הסביבה איתות אנדוגני. עם זאת, הוא גם מרמז על אפשרות נוספת של כוונון של חגיגת/הבטא-catenin איתות במהלך התמיינות, כי החוסן ואת היעילות של בידול עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם את סוגי תאים, שורות תאים שונים תרכובות כימיות של חגיגת-inducers בשימוש על ידי כל אחד.
שיטה זו גם מאפשרת לנו ליצור כל ארבע SM נגזרים MYO, D, SCL, SYN, מתוך iPSCs האנושית. את כל מנגנוני stepwise באמצעות CDM יכול לשמש כדי לזהות את הדרישות איתות במהלך האנושי somitogenesis/somite תכנים, ומספקים תובנות חשובות בהתפתחות SM. לדוגמה, השיטות שלנו יכול להיות שימושי עבור לימוד מנגנוני שעון פילוח, מערכת תנודה מולקולרית המווסת את היווצרות SM. זה ביסודיות נחקר עכברים, אפרוחים, דג זברה, אך לא בבני אדם בשל היעדר ניסוי כלים מתאימים.
יתר על כן, שיטת שלנו יכולה להיות ישימה לטיפולים עתידיות הקלינית מבוססת-תא. לדוגמה, האדם הנגזרות iPSC D או SYN יכול להיות מושתלים לתוך העור נפגע קשות או קרע גידים עבור התחדשות וטיפול. עם זאת, מספר מגבלות צריך להיפתר לפני שיטה זו יכול להיות מיושם באופן מעשי. למרות במחקר הנוכחי, השתמשנו באן מזין תאים עבור iPSC תחזוקה, פתרון ה-ECM, אשר מופק סרקומה העכבר Engelbreth-הולם-נחיל, כמו מעיל משטח על מדיח הכלים במהלך אינדוקציה, ריאגנטים מהחי אלה שאינם בני אדם צריכים להיות הסיר לשיפור איכות קליניים. בנוסף, תאים בכמות ובאיכות, הכוללת את הטוהר ואת ההבשלה של תאי הרצוי, חייב להיות גם שיפור. יתר על כן, לא רק את מספר התאים, אלא גם את הכוח תא הוא מאפיין חשוב עבור התחדשות גיד/רצועה. בנוסף, הפיתוח של סמני פני לטיהור ושל שיטה עבור תלת-ממד שיחזור הן תנאי הכרחי על מנת לקדם את כל מנגנוני טיפולים קליניים מבוססי תאים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות ד ר Junya Toguchida (CiRA) לעזרתו עם מינהלת הפרויקט, מימון הרכישה, מר. מיצואקי (CiRA) ו גב’ מיי Terashima (CiRA) לסיוע טכני שלהם, טויוקה יאיואי ד ר (CiRA), ד ר Daisuke Kamiya (CiRA) עבור שלהם הגהה של כתב היד, מר Masaya Todani (CiRA) לספק המחשה (איור 1). ברצוננו להודות לכל חברי Ikeya ו- Toguchida המעבדות (CiRA) על תמיכתם במהלך מחקר זה. עבודה זו נתמך על ידי Grants-in-aid למחקר מדעי מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) (26670661), התוכנית עבור תאי iPS סורר מחלות מחקר ניצול מחלות ספציפיות של יפן המדע והטכנולוגיה סוכנות (JST), הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED), המרכז הליבה iPS מחקר תאי של רשת מרכז מחקר עבור מימוש של רפואה רגנרטיבית (JST/AMED), שב”ס קרן מחקרים תא (ל מקוטו Ikeya ו Junya Toguchida). מקוטו Ikeya נתמכה גם על ידי Grants-in-aid מחקר מדעי (JSPS) (16H 05447), את תוכנית ההאצה לחקר מחלות סורר ניצול תאי iPS מחלות ספציפיות (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |