Vi presenterar här ett protokoll för differentiering av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller i varje somite derivat (myotome, sclerotome, Dermatom och syndetome) i kemiskt definierade förhållanden, som har tillämpningar inom framtida sjukdom modellering och cellbaserade terapier i ortopedisk kirurgi.
Svar till signaler såsom WNTs bone morphogenetic proteiner (bmp), och sonic hedgehog (SHH) utsöndras från omgivande vävnader, thoraxsegmenten (SMs) ge upphov till flera celltyper, inklusive myotome (MYO), sclerotome (SCL), Dermatom (D) och syndetome (SYN) , vilket i sin tur utvecklas till skelettmuskulaturen, axiella skelettet, dorsala dermis och axiell senor/ligament, respektive. Generering av SMs och deras derivat från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är därför avgörande för att erhålla pluripotenta stamceller (PSC) för tillämpning inom regenerativ medicin och Sjukdomforskning inom ortopedisk kirurgi. Även om induktion protokollen för MYO och SCL från PSC har tidigare rapporterats av flera forskare, har ingen studie ännu visat induktion av SYN och D från iPSCs. Effektiv induktion av fullt kompetenta SMs förblir därför en stor utmaning. Här, sammanfatta vi mänskliga SM mönster med mänskliga iPSCs in vitro-genom att härma signalering miljön under chick/mus SM utveckling och rapport om metoder för systematisk induktion av SM derivat (MYO, SCL, D och SYN) från mänskliga iPSCs under kemiskt definierade villkor genom presomitic mesoderm (PSM) och SM stater. Kunskap om chick/mus SM utveckling tillämpades till induktion av SMs med mänskliga iPSCs. Denna metod skulle kunna vara ett nytt verktyg för att studera mänskliga somitogenesis och mönstring utan användning av embryon och för cell-baserad terapi och sjukdom modellering.
Utveckla en riktad differentiering metod för en önskad celltyp från PSC är ett nödvändigt steg för att omsätta studiet av PSC-derived celler i kliniska tillämpningar. Tvingad uttryck av viktiga gener är en lovande strategi för orgel-celldifferentiering från PSC och har förbättrat vår förståelse av den genetiska regleringen av cell öde bestämning, orgel morfogenes och organisation under embryogenes1. Dessutom anses går igenom de endogena signalering miljöer, med utvecklingen av mus och chick embryon som en färdplan, viktigt för riktad differentiering av PSC. Men är med tanke på tillämpningen av PSC-derived celler i kliniska studier såsom cellbaserade terapier, den sistnämnda strategin mer lämplig eftersom det inte kräver gen manipulation.
Flera studier har rapporterat induktion av mesoderm från människa och mus PSC i kemiskt definierade villkor. Vanligtvis, dessa metoder har förlitat sig på activin/nodal/omvandling tillväxtfaktor β (TGFβ) signalering och bone morphogenetic protein (BMP) signalering, tros utföra meso-endoderm och mesoderm differentiering, vilket resulterar i en låg induktion effektivitet det paraxiala mesoderm (ca 20%)2. Med andra ord, var PSC-derived mesoderm induceras av dessa signalvägar främst laterala plattan mesoderm och inte paraxiala mesoderm. Nyligen, några studier har visat effektiv produktion av PSC-derived paraxiala mesoderm baserat på olika strategier3,4,5,6,7,8 . I dessa studier PSC odlades med relativt höga koncentrationer av glykogen syntetas kinase 3 (GSK3)-hämmare (WNT signalering aktivatorer), följaktligen induktion effektivitet paraxiala mesoderm nådde 70% – 95%6,7 .
I somitogenesis, paraxiala mesoderm första bildar presomitic mesoderm (PSM) posteriort, och sedan thoraxsegmenten (SMs) i den främre delen genom mesenchyme-till-epitelial övergången9,10. Notch ligand Delta-liknande 1 (DLL1) är känd att ha en nyckelroll under somitogenesis, som oscillerande kontroll av DLL1 uttryck, både i mRNA och protein nivå reglerar SM segmentering. SMs så småningom dela upp i två delar, vilket ger upphov till dermomyotome (DM) dorsalt och sclerotome (SCL) ventralt11. Därefter DM gör åtskillnad mellan in i Dermatom (D), en föregångare av dermis och myotome (MYO), en föregångare av skelettmuskulaturen; Dessutom bildar en ventrala delen av SCL syndetome (SYN), en föregångare av senor och ligament12 (figur 1). Vissa forskare har rapporterat induktion av PSC-derived SM derivat såsom MYO4,13 och SCL14; men finns det flera begränsningar i dessa studier. Särskilt, eftersom vår kunskap om signalering miljöer av D och SYN är fragmentariska, har induktion protokoll för D och SYN ännu inte systematiskt fastställts. För att visa full-behörighet SMs inducerad från PSC, är det viktigt att visa flera differentieringen kapacitet av inducerad SMs till alla fyra derivat (D, MYO, SCL och SYN), medan tidigare studier har bara fokuserat på specifika SM derivat. Här rapporterar vi om hur du genererar alla fyra SM-derivat, inbegripet D och SYN, genom PSM och SM öden från iPSCs mänskliga15. Vi tror att upprätta en in vitro-stegvis metod att modeller som SM utvecklingsprocessen kan bidra till studiet av hur människans SM utvecklas under embryogenes, utan att använda embryon.
En välkänd metod för induktion av PSC-derived SM genom PSM är kombinationen CHIR99021 + A83-01 (TGFβ hämmare) under PSM induktion från PSC, men inte under de PSM mognad process6. I den aktuella studien hämmades WNT/beta-catenin signalering använder C59 inducera SM från PSM. Vi införde dock användningen av CHIR99021 aktivera WNT vägen under SM differentiering. Detta beslut gjordes baserad på konstaterandet att flera WNTs uttrycks i omgivande vävnader i SM och med tanke på att WNT reportrar är aktiva i SM20. Vi observerade därför epithelialization, kännetecknande för SM in vivo endast under villkora med CHIR99021, baserat på ansamling av CDH11 i cell cell korsningar (figur 2E). Denna observation visar kritiska medverkan av WNT signalering under PSM differentiering och SM epithelialization, därför våra protokoll kan bättre recapitulate endogena signalering miljön. Men innebär det även en möjlighet att finjustera den WNT/beta-catenin signalering utbildningsavsnitt under differentiering, eftersom robusthet och effektivitet av differentiering kan variera avsevärt beroende på celltyper, cellinjer och olika kemiska föreningar av WNT-inducerare används av varje forskare.
Denna metod också tillåter oss att generera alla fyra SM derivat, MYO, D, SCL och SYN, från iPSCs mänskliga. Vår stegvis protokoll använder CDM kan användas för att identifiera signalering kraven under mänskliga somitogenesis/somite mönstring och ge viktiga insikter i människans SM utveckling. Till exempel kan våra metoder vara användbara för att studera mekanismer för segmentering klocka, en molekylär svängning-systemet som reglerar bildandet av SM. Det har undersökts grundligt i möss, kycklingar och Zebrafiskar, men inte hos människor på grund av bristen på lämpliga experimentella verktyg.
Dessutom kan vår metod tillämpas på framtida kliniska cellbaserade terapier. Till exempel mänskliga iPSC-derived D eller SYN kan transplanteras in i allvarligt skadad hud eller spruckit senor för regenerering och behandling. Flera begränsningar måste dock lösas innan denna metod kan tillämpas praktiskt. Även om i den aktuella studien, vi använde SNL feeder celler för iPSC underhåll och ECM-lösning, som utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom, som en surface pälsen på skålen under induktion, skall dessa icke-mänskliga animaliska reagens vara bort för att förbättra kliniska kvalitet. Dessutom måste cell kvantitet och kvalitet, som omfattar renhet och mognaden av de önskade cellerna, också förbättras. Dessutom är inte bara antalet cell utan även cell styrka en viktig egenskap för senor/ligament regenerering. Dessutom utveckling av yta markörer för rening och en ny metod för 3D beredning är nödvändig för att avancera våra protokoll till kliniska cellbaserade terapier.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Junya Toguchida (CiRA) för hans hjälp med projektadministration och finansiering förvärv, Mr Mitsuaki Shibata (CiRA) och Ms. Mei Terashima (CiRA) för deras tekniskt bistånd, Dr Yayoi Toyooka (CiRA) och Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) för deras korrekturläsning av manuskript, och Mr Masaya Todani (CiRA) för att tillhandahålla en illustration (figur 1). Vi tackar också alla medlemmar i de Ikeya och Toguchida laboratorierna (CiRA) för deras stöd under denna studie. Detta arbete stöds av Grants-in-aid för vetenskaplig forskning från Japan Society för att främjande av vetenskap (JSPS) (26670661), programmet för svårbehandlade sjukdomar forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler från Japan Science and Technology Byrå (JST) och Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (AMED), Core Center för iPS cellforskning Research Center Network för förverkligandet av regenerativ medicin (JST/AMED) och iPS Cell forskningsfond (delvis till Makoto Ikeya och Junya Toguchida). Makoto Ikeya stöddes också av Grants-in-aid för vetenskaplig forskning (JSPS) (16H 05447) och programmet Acceleration för svårbehandlade sjukdomar forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |