Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.
Abstract
ב פרוטוקול זה אנחנו מפרטים שיטה להשיג שברים subcellular של תאים U937 ללא שימוש ultracentrifugation או בדטרגנטים ללא הבחנה. שיטה זו משתמשת מאגרי היפוטוניק, digitonin, פירוק מכני, צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את הציטופלסמה, המיטוכונדריה ואת קרום פלזמה. התהליך וניתן לשנותם כדי להתאים את הצרכים של החוקרים, היא פעולה פשוטה וזולה. שיטה זו יאפשר לחוקרים לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאים ללא בדיקות מיוחדות וללא שימוש קיטים מסחריים, אשר שניהם ניתן לחדשו. אנחנו משתמשים בהצלחה זו שיטה להפרדת cytosolic, קרום פלזמה, חלבונים מיטוכונדריאלי בקו התא האנושי מונוציט U937.
Introduction
זיהוי אמין של חלבון לוקליזציה הכרחי לעתים קרובות בעת בחינת מסלולים מולקולריים בתאים האיקריוטים. שיטות להשגת שברים subcellular מנוצלים על ידי חוקרים לבחון מקרוב את מרכיבי התא עניין.
רוב שיטות קיימות fractionation תא בדרך כלל נחלקים לשתי קטגוריות רחבות, המבוסס על אבקת1,2 ומבוסס-ultracentrifugation3,4,5, אשר יכול להיות מובחנת על ידי מהירות, דיוק ועלות. דטרגנט פרוטוקולים מבוסס מסתמכים על השימוש במאגרים עם הגדלת כוח דטרגנט solubilize רכיבים נפרדים של התא. זו היא שיטה מהירה ונוחה לעיבוד דגימות והוא יכול להיות העלות האפקטיבית אם המספר והגודל של דגימות קטנות. ניתן לרכוש ערכות המבוסס על אבקת לבודד cytoplasmic ממברנה/אברון (שבר מעורב), שברים גרעיני תאים. עם זאת, מספר חסרונות הקשורים עם ערכות אלה להגביל את התועלת שלהם לחוקרים. הם נועדו בקלות לבודד את מרכיבי התא אחד או שניים, אך אינם מסוגלים לבודד כל שברים מתוך מדגם בו-זמנית. השימוש של דטרגנטים אומר כי קרום פלזמה של organelles מוקף קרום להיות באותה מידה solubilized ולכן אין אפשרות להיות מופרדים אחד מהשני. סיבוך נוסף נובע הרכיבים קניינית ערכות אלה אשר מונעת חוקרים שינוי התנאים עבור יישומים ספציפיים. לבסוף, הם מוגבלים למספר שימושים, עשוי להיות יקר מדי עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר. ערכות בסיס חומרי שאינם קיימים עבור בידודו של המיטוכונדריה, עם זאת, הם לא נועדו כדי לבודד קרום פלזמה, התשואה מדגם הוא משמעותית פחות מזה של צפיפות צנטריפוגה מבוסס בידוד פרוטוקולים6,7 .
שיטות לנצל ultracentrifugation להשיג שברים הם יותר זמן צריכת, אבל לעתים קרובות התוצאה בחלקים מזוכך יותר ערכות מבוססי דטרגנט. כדי לבודד ממברנות פלזמה מתאי ללא הראשון solubilizing אותם (וכתוצאה מכך זיהום עם קרום organelles) דורש מהם כדי להיות lysed על ידי שיטה ללא חומרי ואחריו ההפרדה של מרכיבי התא באמצעות דיפרנציאל צנטריפוגה — עם בידוד קרום פלזמה הדורשים מהירויות של × 100,000 g כדי להשיג. במקרים רבים, צנטריפוגה דיפרנציאלית חייב להיות במעקב על-ידי isopycnic צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה להפרדה נוספת של שברים הסלולר או הסרה של מזהמים. בעוד ששיטות אלה הם יסודי ומשתנות, החסרונות כוללים עלות צריכת זמן, את הצורך ultracentrifuge על הפרדה בין שברים ומספרים נוספים טיהור באמצעות צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. צנטריפוגות במהירות גבוהה ביותר הן בעלות זה אוסרני עבור חוקרים בודדים ולעיתים קרובות משותף, ליבה של ציוד במוסדות אקדמיים. לפיכך, זמינות ultracentrifuge הופך אוסרני במצבים אלה.
ב פרוטוקול fractionation זה נדגים את ניתוקה של שברים subcellular ללא שימוש solubilizing דטרגנטים וללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר חוקרים לבודד את קרום פלזמה, המיטוכונדריה, cytoplasmic מרכיבי תא האיקריוטים עם זיהום מזערי בין שברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים Buffers וראגנטים
הערה: ראה טבלה 1.
- להכין פתרונות של מאגר A, פירוק מאגר B, מאגר מדגם digitonin.
- להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים.
הערה: ריכוזי הסופי הם 150 מ מ NaCl 50 מ מ HEPES. - הכנת מאגר פירוק B על-ידי הוספת 20 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4), 0.75 גר' אשלגן כלורי, 0.19 גר' MgCl2, 2 מ ל חומצה Ethylenediaminetetraacetic (0.5 M EDTA), 2 מ של-אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (0.5 M EGTA) , 38.26 g של מניטול ו- g 23.96 של סוכרוז עד 900 מ"ל של מים יונים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר מים יונים.
הערה: ריכוזי הסופי הם 20 מ מ HEPES, 10 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl2, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, 210 מ מ מניטול וסוכרוז 70 מ"מ. - להכין מאגר לדוגמה על-ידי הוספת 0.01 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 10 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS) ריכוז סופי של 0.1% מרחביות.
- להכין פתרון מניות של digitonin על-ידי הוספת 25 מ ג של digitonin 100 מ של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 250 µg/mL).
- אחסן את כל מאגר הפתרונות ב 4 ° C ו digitonin ב-20 ° C עד תחילת הניסוי.
- להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים.
- להכין טרי פתרונות של מעכבי פרוטאז, פוספטאז להוסיף מאגר פתרונות לפני תוספת לתאים.
- להכין פתרון מניות של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) על-ידי הוספת 17.4 מ"ג של PMSF 1 מ"ל אתנול 100% (הריכוז הסופי הוא 100 מ מ).
התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים וזהירות פעילות גופנית בעת טיפול PMSF. PMSF הוא מסוכנים אם בולעים אותם מעט מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי) או שאיפה; . זה שמשחית העיניים והעור. - להכין קוקטייל מעכב פרוטאז זמינים מסחרית (100 ×) לפי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).
- להכין פתרון מניות של נתרן orthovanadate (SOV) על-ידי הוספת 92 מ ג SOV 1 מ"ל של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 500 מ מ).
התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים, נהג בזהירות בעת הטיפול. SOV הוא מסוכן במקרה של קשר עין (גירוי), בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.
- להכין פתרון מניות של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) על-ידי הוספת 17.4 מ"ג של PMSF 1 מ"ל אתנול 100% (הריכוז הסופי הוא 100 מ מ).
2. PBS לשטוף
- להתרכז ולשטוף תאים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לפני fractionation.
- צנטריפוגה תא ההשעיה במהירות המתאימה ליצירת גלולה. לדוגמה, centrifuge השעיה של תאים U937 ב × 400 g למשך 10 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS בטמפרטורת החדר-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
- Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות הצניפה תאים.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה תא קר כקרח מאגר A-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל.
הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב 4 ° C או על קרח, כל מאגרי צריך להיות טרום מקורר.
3. בידוד חלבון cytosolic
- תמצית חלבונים cytosolic על ידי דגירה עם digitonin דטרגנט.
- מייד לפני resuspension של תאים (שלב 3.1.3) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ), 10 µL של מעכבי פרוטאז (100 ×), µL 2 מניות SOV (500 מ מ) ו- µL 100 של digitonin מניות (250 µg/mL) כדי µL 878 מאגר A (ריכוזים הסופי הם 1 מ מ PMSF , 1 × מעכב פרוטאז, 1 מ"מ SOV, digitonin µg/mL 25; לכוון את עוצמת הקול הסופי לפי מספר התאים בשימוש). לשמור את הפתרון על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
- Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב בופר A המכיל מעכבי ו digitonin (להכין בשלב 3.1.1)-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
- דגירה התליה תא על מסובב מעל קצה--4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- Centrifuge התליה תא ב × 400 g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה נקי.
- Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו ב × 18,000 g למשך 20 דקות הצניפה פסולת הסלולר.
- להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
- חזור על שלבים ו 3.1.5 3.1.6 עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
- לאסוף את תגובת שיקוע המכיל חלבונים cytosolic ואחסן אותו ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
- להסיר את עודף digitonin, חלבונים cytosolic על ידי צנטריפוגה.
- Resuspend בגדר תא digitonin-permeabilized (מתוך שלב 3.1.5) במאגר A-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
- Centrifuge התליה תא digitonin-permeabilized ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
הערה: ניתן לבצע חוזרות שוטף במאגר A כדי להסיר עודפי מזהמים cytosolic.
4. תא המגון
- דגירה התאים על הקרח במאגר פירוק B ואת lyse אותם באמצעים מכניים.
- מייד לפני resuspension של תאים (שלב 4.1.2) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ) µL 2 מניות SOV (500 מ מ) µL 988 פירוק מאגר B (ריכוזים הסופי הם 1 מ PMSF ו 1 מ"מ SOV; להתאים את עוצמת הקול הסופי כדי להכיל את מספר התאים להיות lysed) ולשמור על solu tion על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
- Resuspend בגדר תא (מתוך שלב 3.2.2) תוך קר כקרח פירוק B בופר המכילה PMSF ו SOV (להכין בשלב 4.1.1)-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל.
- דגירה התליה תא על קרח למשך 30 דקות.
- להעביר את המתלים תא מהמגן דאונס טרום מקורר (עם B ההדוקות כבעלי) על הקרח ולבצע עובר 40 עם איחדו מהמגן בתנועות איטיות, משיחות אפילו.
הערה: לחלופין לנצל אמצעים אחרים של פירוק מכני תא כמפורט בסעיף הדיון. - לאסוף את homogenate, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה נקי.
- לשטוף מהמגן איחדו את התחתית עם נפח קטן (1-2 מ ל) של פירוק מאגר B ולהוסיף אותו homogenate.
- Centrifuge את homogenate × 400 גרם (או את המהירות המינימלי הנדרש כדי הצניפה תאים רצופה) למשך 10 דקות.
- להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
הערה: אם גלולה משמעותי נותר חזור על שלבים 4.1.4 דרך 4.1.6 להגברת שברים כמו מפורט במקטע דיון. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, homogenate השמורים ב 4 ° C לטווח קצר (24 שעות).
5. צנטריפוגה דיפרנציאלית
- Centrifuge את homogenate בהגברת מהירויות להסרת פסולת הסלולר, המיטוכונדריה ולבודד ושברים ממברנה.
- Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 4.1.8) ב × 500 g עבור תגובת שיקוע העברת 10 דקות כדי שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
- Centrifuge תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.1) ב × 1000 גרם במשך 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
- Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.2) ב × 2,000 g עבור 10 דקות להעביר תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
- Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.3) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות העברה תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, לשמור על גלולה המכילה המיטוכונדריה.
- Resuspend בגדר המיטוכונדריה באמצעי אחסון קטן (0.5\u20121 מ"ל) פירוק מאגר B.
- Centrifuge בגדר תנאי ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע ואת resuspend מיטוכונדריאלי צניפה בהיקף הסופי הרצוי של מאגר מדגם (למשל, 250 עד 500 µL, בהתאם לגודל בגדר והרצוי ריכוז).
- צנטריפוגה תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.4) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי. חזור על שלב זה עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
- לסובב את תגובת שיקוע ב × 18,000 g עבור 3 שעות.
- הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את גלולה המכילה חלבונים ממברנה. Resuspend בגדר ממברנה באמצעי אחסון קטן (0.5-1 מ ל) של פירוק מאגר B.
- Centrifuge בגדר תנאי ב × 18,000 g עבור 1 h.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ממברנה באמצעי הסופי הרצוי דוגמת המאגר (250 עד 500 µL, בהתאם לגודל של גלולה, הריכוז הרצוי).
- Sonicate כדורי מדגם 3 s באמבט קרח בקביעה כוח של 5 (50% של 125 כוח מרבי W ב-20 קילו-הרץ, ראה טבלה של החומרים).
- אחסן את הדגימות ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
- לבחון את הדגימות טוהר של fractionation על ידי ביצוע של תספיג ניצול נוגדנים נגד סמני חלבונים נמצאו בתאים ציטופלזמה, המיטוכונדריה, הממברנה של התא (עיין בסעיף התוצאות נציג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fractionation מוצלחת של U937 מובחן8 תאים גדל ההשעיה הושג באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, מאויר באיור1. הדגימות שהושג עם שיטה זו היו נענשים המערבי סופג9 ניצול שיטת העברה רטוב כדי קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene. הקרום נבדקה לאחר מכן עם נוגדנים נגד cytoplasmic, מיטוכונדריאלי, ממברנה מקומי סמני חלבונים (איור 2, איור 3, איור 4). החילוץ מוצלחת של חלבונים cytoplasmic ניתן לאמת ע י חקירת את האבן החשופה עם נוגדנים נגד חלבון cytosolic גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז10 (GAPDH), בדרך כלל לשפות אחרות אל הציטופלסמה של התא. כפי שהראה את immunoblot (איור 2; פאנל התחתונה, מסלולים 1 ו- 2), GAPDH נמצא רק digitonin חילוץ ודוגמאות אין חשש לזיהום הוא ציין את כדורי g 4,000 × (איור 4; נתיבי 3 ו- 4 בפאנל התחתון) או 18,000 × g כדורי (איור 4; נתיבי 5 ו- 6 בפאנל התחתון). בודק את התעלה אניון תלויי-מתח (VDAC), חלבון מקומית הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי11, מציג את הבידוד מוצלח של המיטוכונדריה 4,000 × g כדורי (איור 4; נתיבי 3 ו- 4 על האמצע לוח), ואילו העדר של חלבון זה בחלקים אחרים מראה חוסר זיהום מיטוכונדריאלי 18,000 כדוריות g × או דגימות digitonin, חילוץ. בודק את יחידת משנה α1 נה/K-ATPase, חלק heterodimer ממברנלי אינטגרלי נמצא בעיקר אצל קרום פלזמה12, מציג את הרוב המכריע של חלבון זה ממוקם כ-18,000 × g כדורי (איור 4; נתיבי 5 ו- 6 על גבי לוח). חלבון זה הוא זוהה גם כדורי g 4,000 × (איור 4; נתיבי 3 ו- 4 של הפאנל העליון), רומז זיהום אפשרי עם קרום פלזמה, למרות שאפשרות זו לא סביר במהירות נמוכה שבה הושג גלולה זו. הסבר יותר מתקבל על הדעת הוא הנוכחות של רשתית תוך-פלזמית (ER) בדוגמת 4,000 × g כדורי, כמו הובלה של Na, subunits K-ATPase מחדר המיון כדי קרום פלזמה הוכח על ידי חוקרים13. חוסר נה, K-ATPase חלבון α1 הדגימות digitonin חילוץ (איור 4; נתיבי 1 ו- 2 על הלוח העליון) מדגים את הטוהר של השבר הזה.
בניגוד התוצאה ציין במהלך fractionation מוצלח (איור 2), ביצוע לקוי של הפרוטוקול יכול לגרום צלב זיהום של מרכיבי התא (איור 3, איור 4). ריכוז גבוה של Na, K-ATPase α1 חלבון ב- 4,000 × g כדורי, בהשוואה לכדורי g × 18,000 (איור 3 {החלונית העליונה, ליין 2-3], איור 4B [הדף פאנל, מסלולים 5-12]), מציין כי השבר אברון יש היה מזוהם עם קרום פלזמה חלבונים. הנוכחות של GAPDH של כל שבר חוץ המדגם cytoplasmic חילוץ digitonin (איור 3 [פאנל התחתונה, ליין 4] ו- איור 4A [פאנל התחתונה, מסלולים 5-12] הוא מצביע על כשל להסיר חלבונים cytoplasmic בצעדים העוקבים.
איור 1: תרשים של פרוטוקול Fractionation תא. מבט כולל על פרוטוקול fractionation תא מיוצג תרשים זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בידוד מוצלחת של הציטופלסמה תא U937, אברון, ממברנה שברים. שהכלים המערבי של שברים תא מבודד שתי תרביות תאים U937, ובחן עבור סמנים של הממברנה (Na, α1 K-ATPase, החלונית העליונה), המיטוכונדריה (VDAC, בחלונית האמצעית) הציטופלסמה (GAPDH, החלונית התחתונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כשל Fractionate רכיבים תא U937. שהכלים המערבי של שברים תא מבודד U937 תא תרבות מציג זיהום של השבר אברון (ליין 2) עם נה, K-ATPase α1 (החלונית העליונה) ואובדן של רכיבים cytoplasmic לתוך תגובת שיקוע של בגדר ממברנה (ליין 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לחצות זיהום של Cytoplasmic ורכיבי קרום במהלך Fractionation. (א) Fractionation ניסיון עם זיהום לחצות cytoplasmic של GAPDH ב אברון (פאנל התחתונה, מסלולים 5-8) ושברים ממברנה (פאנל התחתונה, סמטאות 9-12). Fractionation (B) ניסיון עם קרום פלזמה זיהום של Na, K-ATPase בחלקים מיטוכונדריאלי (החלונית העליונה, מסלולים 5-8). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | קומפוזיציה (ריכוז מניות) | ריכוז סופי |
| מאגר A | NaCl (150 מ"מ) ו HEPES (50 מ מ) | 1 X (כמו מניות) |
| פירוק מאגר B | HEPES (20 מ מ), אשלגן כלורי (10 מ מ), MgCl2 (2 מ מ), EDTA (1 מ מ), EGTA (1 מ מ), מניטול (210 מ"מ), סוכרוז (70 מ מ) | 1 X (כמו מניות) |
| מאגר דוגמאות | Dodecyl נתרן גופרתי (0.1%) בתוך תמיסת מלח באגירה טריס | 1 X (כמו מניות) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) במים יונים | µg 25/ml |
| Phenylmethanesulfonyl פלואוריד | Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (100 מ מ) ב- 100% אתנול | 1 מ מ |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | משתנה (ראה יצרן המוצר גיליון) | 1 X |
| נתרן Orthovanadate | נתרן Orthovanadate (500 מ מ) במים יונים | 1 מ מ |
טבלה 1: מאגרי ופתרונות. ההרכב של מאגרי והפתרונות הנדרשים עבור ההליך.
| פרוטוקול שלב | גורם קריטי | הסבר | בעיות אפשריות | פתרונות אפשריים |
| הכנה תא | ריכוז תא | ריכוז אופטימלי של תאים, כי שיטה זו יכולה לעבד צריכה להיקבע מדעית עבור סוג התא להיות עבד עם כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. | תא מרוכז המתלים עלול לגרום פירוק לא יעיל, שמוביל תשואות נמוכות של המיטוכונדריה, ממברנה שברים. | לבצע הליך ראשוני עם טווח של תאים ריכוזים כדי לקבוע את התוצאות הטובות ביותר. |
| מראש עיבוד של תאים | התאים חייבים להיות ההשעיה להליך, fractionation, הדבר דורש ניתוק תאים חסיד של תרבות משטחים או homogenizing רקמות. | עיבוד לא יעיל עלול לגרום בתשואות השבר נמוכה, צלב זיהום בין שברים subcellular או אחרים תוצאות בלתי צפויות. | ודא כי השיטה המועסקים תוצאות בתאים מספיק עבור ההליך. לספור תאים ההשעיה כדי לקבוע ריכוז לאחר העיבוד משתנות בהתאם. | |
| אם השיטה המועסקים הפשרות קרום פלזמה, פירוק מוקדמת עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך צלב זיהום של שברים. | ודא כי קרום פלזמה שלמות נשמר במשך הקציר תא על-ידי שימוש בשיטות למנוע נזק לתא. ודא הקרומיות בבדיקה במיקרוסקופ עם ההכללה של צבע אטום ממברנה (כגון Trypan blue). | |||
| בידוד חלבון cytosolic | ריכוז Digitonin | ריכוז אופטימלי של digitonin צריכה להיקבע כדי למנוע פירוק של תאים תוך מתן אפשרות חילוץ חלבון cytosolic דרך הנקבובית היווצרות. | ריכוזים גבוהים של digitonin עשויה להוביל ממברנה קרע, פירוק תאים, זיהום של השבר cytosolic. ריכוזי שיוצרת תגרום חילוץ לא יעיל של חלבונים cytosolic, זיהום אפשרי לחצות שברים עוקבות. | צריך להיות ירד הריכוז של digitonin אם פירוק התא מופרז נצפית. גלולה תאים קטנים שהושג לאחר דגירה digitonin עשוי להצביע על קרום קרע וסלולרי פירוק. |
| לשטוף לאחר החילוץ | הסרה של digitonin, חלבונים cytosolic מתאי permeabilized יש לבצע כדי למנוע זיהום לחצות. | כשל לרחוץ תאים מספיק אחרי החילוץ cytosolic עלול לגרום לשאת מעבר של חלבונים cytosolic שברים אחרים. | נוספים שוטף עם מאגר קהל מעריצים digitonin הדגירה לדלל digitonin ואת הנותרת חלבונים cytosolic. | |
| בידוד מיטוכונדריאלי | פירוק התא | שיטות פירוק חייב להיות יסודי לפרסם תוכן סלולרי, תוך שמירה על תקינות מיטוכונדריאלי לבידוד עוקבות. | פירוק מכני של תאים עשוי להיות יעיל, שמירה על תאים שלמים ולא והתוצאה תהיה הנמוכה תשואות של חלבונים מיטוכונדריאלי. | מידת הכוח הנדרש lyse תאים ולשחרר המיטוכונדריה צריכה להיקבע מדעית עבור סוגי תאים שונים. פלטות גדולות שהושג לאחר השלב פירוק (כמו גם כדורי פלסטיק קטנים מיטוכונדריאלי, ממברנה) עשוי להצביע על פירוק שיוצרת. להגדיל את כמות כוח (משיחות המרוסקים, המחט מעברים, וכו ') כדי למזער בגדר פירוק פוסט. |
| יותר מדי כוח מכני ייתכן lyse המיטוכונדריה, מזהם את השבר קרום פלזמה עם ממברנה מיטוכונדריאלי חלבונים. | להקטין את כמות כוח אם סמני חלבונים מיטוכונדריאלי נמצאו בדגימות ממברנה. | |||
| הסרת פסולת | בטח ניתן להסיר תאים שלמים, שברים גדולים יותר homogenate בעקבות פירוק כדי להימנע מזיהום מיטוכונדריאלי דגימות. | יכול להיות מזוהמים דגימות מיטוכונדריאלי עם רכיבים cytoplasmic או קרום פלזמה חלבונים אם פסולת ותאים שלם לא יוסרו לפני pelleting המיטוכונדריה. | להגדיל את מספר השלבים צנטריפוגה מהירות נמוכה לפני ספין מיטוכונדריאלי בידוד. אם התשואה מיטוכונדריאלי נמוכה, ייתכן צורך להציל את החבילות של ספינים מהירות נמוכה ולבדוק דרך תספיג לסמני מיטוכונדריאלי. | |
| בידוד שלאחר שטיפת | דגימות מיטוכונדריאלי צריך לרחוץ ביסודיות להסיר פסולת מזהמים כי ייתכן הצניפה איתם. | תא קטעים מאי הצבירה של עמית עם המיטוכונדריה, מובילים לחצות זיהום של cytoplasmic או קרום חלבונים. | ודא כי כדורי מספיק נשטפים עם מאגר כדי להסיר לכלוך. | |
| ממברנה בידוד | זמן צנטריפוגה | צנטריפוגה פעמים ייתכן שיהיה עליך להרחיב כדי להגדיל את התשואה של קרום שבר דגימה. | בהתאם את המספר הכולל של תאים מעובד את היעילות של פירוק התא, ממברנה שבר דגימה התשואה עשוי להיות נמוך. | הגדלת הזמן צנטריפוגה עשוי לשפר את התשואה של קרום פלזמה שבר. הזמן המומלץ הוא מספיק בשביל ההתחלה כמות גדולה של תאים, פעמים יותר יהיה צורך בכמויות קטנות יותר. |
בטבלה 2: שלבים קריטיים. טבלת סיכום של פרוטוקול צעדים, בעיות פוטנציאליות ופתרונות אפשריים לפתרון בעיות בפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח של פרוטוקול זה עלתה מחוסר היכולת להפריד מיטוכונדריאלי ודוגמאות ממברנה, באמצעות ערכות זמינים מסחרית, לניתוח של חלבון לוקליזציה במהלך necroptosis14. המגבלות העיקרי של ערכות premade הם היכולת שלהם להתאים את הצרכים של חוקרים בודדים, שלהם עלות לדוגמה, מספר מצומצם של דוגמאות מסוגל להיות מעובד. השיטה המוצגת כאן יכול להתבצע ללא שימוש ריאגנטים יקר וללא הצורך של ציוד יקר. בשיטה זו וניתן לשנותם כדי להכיל כל מספר של תאים, והוא מסוגל להיות משתנה בהתאם לצרכים של חוקרים. פעולה זו מאפשרת את התשואה של כל שבר צריך להיות מוגברת, תפירה של צעדים כדי המחקר המתבצעת וגמישות בביצוע של השיטה. יכול להיות מושמט התוספת של נתרן orthovanadate במאגרי אם החוקרים בוחנים לא המדינה זרחון של חלבונים הדגימות הסופי. באופן דומה יכול להיות מושמט הכללת מרחביות במאגר הסופי אם חוקרים רוצים עוד יותר לטהר את דגימות ויה צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. בעוד אנחנו רק השתמשו בשיטה זו כדי בהצלחה fractionate U937 תאים, קו תא מונוציט שאינו חסיד, ההליך יש לעבוד עם מספר שורות תאים ורקמות, עם שינויים קלים. התאים גדל ההשעיה יכול מגורען בדומה לתאים U937 מפורטות כאן, בעוד שורות תאים חסיד דורשים דיסוציאציה מהמשטח צמיחה לפני תחילת פרוטוקול זה. באופן דומה, רקמות חייב הומוגני ביסודיות לפני fractionation של המכיל תאים. זה יכול להתבצע על ידי ניצול מתאים רופפים דאונס מהמגן, מהמגן זכוכית-polytetrafluoroethene פוטר-Elvehjem או על ידי אחרים (מסחרי) שיטות15.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול שדורשים תשומת לב זהירה כדי להשיג תוצאות אופטימליות ושברים טהור (טבלה 2). הריכוז של תאים מומלץ כאן (שלבים 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 ו 4.1.2) ספציפיים לתאי U937 והיו נחושים באמצעות ניסוי וטעייה. ערכים אלה ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי להכיל סוגים שונים של תאים אם התוצאות שיוצרת מתקבלים בעת ביצוע פעולת בפרוטוקול. במהלך השלב החילוץ cytoplasmic (שלב 3.1), הריכוז של digitonin חייב להיות מספיק כדי permeabilize קרום פלזמה ללא לגמרי lysing את התאים. בעקבות זה דגירה, תאים יש לרחוץ היטב כדי להסיר חלבונים cytosolic והשלבים או זיהום לחצות תתרחש בדגימות במורד הזרם (איור 4A). הצעד המגון (שלב 4.1.4) יכול להתבצע עם כל צורה של פירוק מכני, למרות התוצאות המובאות כאן התקבלו עם דאונס מהמגן. קיימת חלופה לשימוש מהמגן דאונס היא לעבור שוב ושוב את התאים דרך מחט צר מד (27 גרם מומלץ, עובר 20-40) עד פירוק התא מספיק מושגת. יתכן צורך להגדיל את מספר קווים (או מזרק עובר) אם גלולה גדול של תאים רצופה מתקבל לאחר המגון (שלב 4.1.7). חוקרים סביר צריך לקבוע את כמות אופטימלית המגון עבור סוג התא להיות fractionated. פינוי פסולת הסלולר בעקבות המגון את חייב להיות יסודי כדי למנוע זיהום של השבר אברון עם קרום פלזמה רכיבים (איור 4B). אם הדבר יתרחש, מהירות נמוכה נוספת צנטריפוגה צעדים צריכה להתבצע כדי להסיר את הלכלוך הסלולר. במהלך הפיתוח של שיטה זו נבחנה עד 18 h של צנטריפוגה ב 18,000 × g , עם עלייה מזערית של קרום פלזמה התשואה מעל הסחרחורות 3 h (איור 2, מסלולים 5-6). חוקרים עלול למצוא אותו להגדיל צנטריפוגה פעמים כדי להשיג יותר התשואות של המדגם קרום פלזמה.
השיטה המוצגת כאן היא מוגבלת לעומת שיטות טיהור יסודית יותר מעורבים ultracentrifugation. ללא שימוש isopycnic צפיפות צנטריפוגה בלתי אפשרי להפריד בין הבודדים organelles שהושג לאחר המגון תא. בעוד שברים g × 4,000 להכיל המיטוכונדריה (כפי שמעידים הנוכחות של VDAC, איור 2), הם כנראה גם מכילים ER, גולג'י נוספים organelles תאיים. השבר אברון צריך לאמת על ידי השימוש של נוגדנים נוספים סמני חלבונים של אחרים organelles אם זה חשיבות המחקר המתבצעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה נתמכה על ידי NIH-1R15HL135675-01 כדי טימותי ג' רוקה
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
