Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l’uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l’esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.
Abstract
In questo protocollo abbiamo dettaglio un metodo per ottenere le frazioni subcellulari delle cellule U937 senza l’uso di ultracentrifugazione o detergenti indiscriminati. Questo metodo utilizza buffer ipotonico, digitonina, Lisi meccanica e centrifugazione differenziale per isolare il citoplasma, mitocondri e membrana plasmatica. Il processo può essere scalata per soddisfare le esigenze dei ricercatori, è poco costoso e semplice. Questo metodo permetterà ai ricercatori di determinare la localizzazione della proteina in cellule senza centrifughe specializzati e senza l’uso di kit commerciali, entrambi i quali possono essere proibitivi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per separare citosolico, membrana plasmatica e proteine mitocondriali nella linea cellulare umana monociti U937.
Introduction
Una identificazione affidabile di localizzazione della proteina è spesso necessaria quando si esaminano le vie molecolari in cellule eucariotiche. Metodi per ottenere le frazioni subcellulari sono utilizzate dai ricercatori di esaminare più attentamente i componenti cellulari di interesse.
La maggior parte dei metodi esistenti di frazionamento cellulare rientra generalmente in due ampie categorie, detergente a base di1,2 e basati su ultracentrifugazione3,4,5, che può essere differenziati per velocità, precisione e costo. Protocolli base detergente si basano sull’uso dei buffer con aumento della forza detergente per solubilizzare le distinte componenti della cellula. Questo è un metodo veloce e conveniente per l’elaborazione di campioni e può essere conveniente se il numero e le dimensioni dei campioni sono piccole. Detergente a base di kit possono essere acquistati per isolare citoplasmico membrana/organello (frazione mista) e frazioni nucleari dalle cellule. Tuttavia, parecchi inconvenienti connessi con questi kit limitano la loro utilità per i ricercatori. Essi sono progettati per isolare facilmente uno o due componenti della cellula, ma sono in grado di isolare tutte le frazioni da un campione contemporaneamente. L’uso di detergenti significa che la membrana plasmatica e degli organelli membrana-racchiuso saranno ugualmente essere solubilizzati e, quindi, incapace di essere separati uno da altro. Un’ulteriore complicazione deriva dai componenti proprietarie in questi kit che impedisce i ricercatori di alterare le condizioni per applicazioni specifiche. Infine, essi sono in numero di impiego limitati e può essere proibitivi per esperimenti su scala più grandi. Kit base detergente non esiste per l’isolamento dei mitocondri, tuttavia, essi non sono progettati per isolare la membrana plasmatica e la resa del campione è significativamente inferiore a quello da centrifugazione di densità basato isolamento protocolli6,7 .
Metodi che utilizzano il ultracentrifugazione per ottenere frazioni sono più termini di tempo, ma spesso risultato in frazioni più pure rispetto a kit a base di detergente. Per isolare il plasma membrane ottenute da cellule senza prima solubilizzanti li (con conseguente contaminazione con gli organelli membrana) richiede loro di essere lisati mediante un metodo non detergente, seguito dalla separazione di componenti cellulari tramite differenziale centrifugazione — con isolamento della membrana plasmatica che richiedono velocità di 100.000 × g per compire. In molti casi, centrifugazione differenziale deve essere seguita da centrifugazione in gradiente di densità isopicnica per un’ulteriore separazione di frazioni cellulari o la rimozione di contaminanti. Mentre questi metodi sono meticolosi e modificabile, gli svantaggi comprendono costo, consumo di tempo e la necessità di un’ultracentrifuga per la separazione di frazioni e ulteriore purificazione tramite densità centrifugazione su gradiente. La maggior parte delle centrifughe ad alta velocità sono ad un costo che è proibitivo per inquirenti e sono spesso condivisi, principali attrezzature alle istituzioni accademiche. Così, disponibilità ultracentrifuga diventa proibitivo in queste situazioni.
In questo protocollo di frazionamento dimostriamo l’isolamento delle frazioni subcellulari senza l’uso di detergenti di solubilizzanti e senza centrifugazione ad alta velocità. Questo metodo permetterà ai ricercatori di isolare la membrana plasmatica, mitocondri e componenti citoplasmatici di una cellula eucariotica con contaminazione minima tra frazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di questo protocollo è sorto da un’incapacità di separare mitocondriale e campioni di membrana, usando i kit disponibili in commercio, per analisi di localizzazione della proteina durante la necroptosis14. Le limitazioni primarie di premade kit sono loro incapacità di essere adattato alle esigenze dei singoli ricercatori, loro costo per campione e numero limitato di campioni in grado di essere elaborati. Il metodo presentato qui può essere eseguito senza l’uso di reagenti costosi e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro è stato supportato da NIH-1R15HL135675-01 di Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referencias
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
